Транскрипция, процессинг

1.

ТРАНСКРИПЦИЯ
• процесс синтеза РНК на матрице ДНК, происходящий
во всех живых клетках
транскрипция
ДНК-зависимая РНК-полимераза

2.

ДНК-зависимая РНК-полимераза
прокариот
У бактерий один и тот же фермент
катализирует синтез трех типов РНК:
мРНК, рРНК и тРНК.
РНК-полимераза — крупная
молекула. Состоит из пяти
субъединиц (~400 кДа): α2ββ'ω
(корфермент)
Для связывания с промоторными
областями ДНК необходима еще одна
субъединица — сигма (σ). Сигмафактор значительно снижает
сродство РНК-полимеразы к
неспецифичным областям ДНК, и
повышает ее чувствительность к
определенным промоторам. С его
помощью транскрипция начинается с
нужного участка ДНК

3. РНК-полимераза прокариот

Функция
α (две)
36,5
150
Взаимодействие с ДНК и
факторами транскрипции
Элонгация
155
Связывание с ДНК
11
Поддерживает конформацию
β’-субъединицы, агрегацию
её с α2β
85
Связывание с промотором
β
β’
ω
σ
Холофермент
Масса, кДа
Кор-фермент
Субъединица

4.

РНК-полимеразы эукариот
• РНК-полимераза I, синтезирующая
высокомолекулярные (18S, 5.8S и 28S) рРНК.
• РНК-полимераза II, производящая
предшественников для мРНК, а также для большинства мяРНК
• РНК-полимераза III, синтезирующая все тРНК, 5S
рРНК и ряд низкомолекулярные РНК (нмРНК).

5.

6. Схемы взаимодействий субъединиц РНК-полимераз I (А), II (Б) и III (В)

А
Б
В

7. Ориентиры

5’
3’
смысловая (кодирующая) цепь ДНК
антисмысловая цепь ДНК
Транскрипция идёт с антисмысловой цепи ДНК
5’
3’
Пре-мРНК
тРНК несут
антикодоны
3’
5’

8.

ЭТАПЫ ТРАНСКРИПЦИИ
1. Инициация – узнавание ДНК-промотора и
сборка РНК-полимеразы
2. Элонгация – синтез пре-мРНК
3. Терминация – остановка синтеза пре-мРНК,
распад РНК-полимеразы

9.

Инициация транскрипции у прокариот
- Транскрипция инициируется при образовании стабильного комплекса между
холоферментом РНК-полимеразы и специфической последовательностью в ДНК -
промотор
- Промотор располагается в начале всех транскрипционных единиц. Состоит
примерно из 40 пар нуклеотидов и расположен непосредственно перед участком
инициации транскрипции.
- В нем различают две важные и достаточно консервативные по составу
последовательности.
1. состоит из 6 или 7 нуклеотидов (чаще ТАТААТ) и расположена на расстоянии
примерно 10 нуклеотидов от первого транскрибируемого нуклеотида (+1) —
-10-последовательность (Прибнов-Бокс). В данном сайте РНК-полимераза связывается
с ДНК.
2. Вторая последовательность расположена на расстоянии -35 нуклеотидов и служит
участком распознавания промотора РНК-полимеразой

10.

Инициация транскрипции у прокариот
3
Кор 2
4фермент TATAAT
2
TTGACA
TATAAT
2
-35
-10
1

11.

Регуляция инициации транскрипции у прокариот
Оперон - группа генов, транскрибируемых в составе одной РНК;
регулируются совместно и обычно обладают общей функцией.
Большинство бактерий содержат несколько -субъединиц, которые отвечают
за узнавание разных типов промоторов и транскрипцию различных групп
генов
Escherichia coli:
70 – гены “домашнего хозяйства”
32 – тепловой шок
38 – стрессовые условия
54 – азотный обмен

12.

Инициация транскрипции у эукариот
• TATA блок (блок Хогнесса) -25
• CAAT-блок -70…-80

13. Регуляция при инициации транскрипции эукариот

1. Множественность РНК полимераз: для инициации транскрипции
каждая из этих РНК-полимераз должна присоединиться к
соответствующим промоторным последовательностям на ДНК
2. Воздействие на общие и специфические факторы инициации
транскрипции и варьирование их комбинаций в инициаторном комплексе
(за счет изменения активности каждого фактора или за счет создания
уникальных сочетаний белковых факторов, как общих, так и
специфических)
3. Изменение структуры хроматина – метилирование ДНК, регуляция
гистонами и другими белками
4. Действие энхансеров и сайленсоров (комбинационная регуляция)

14.

Регуляция транскрипции у эукариот
Ядерный скелет
Эн
Эн
П
Э1
И1
Э2
И2
Э3
И3
Э4
Эн
Энхансер — последовательность ДНК, которая после связывания с ним факторов
транскрипции стимулирует транскрипцию с промотора гена.
Сайленсер — последовательность ДНК, с которой связываются белки-репрессоры
(факторы транскрипции), которое приводит к понижению или к полному подавлению
синтеза РНК ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Сайленсеры могут
находиться на расстоянии до 2500 пар нуклеотидов от промотора
Месторасположение энхансеров
1) как в 5'-, так и в 3'-положении относительно матричной цепи регулируемого гена
и в любой ориентации к ней
2) внутри интронов
3) Даже на другой хромосоме

15.

Элонгация транскрипции
Движение РНК-полимеразы по матрице со скоростью около 30-40 нуклеотидов в
сек: впереди - происходит расплетание, а позади — восстановление двойных
связей в ДНК. Одновременно освобождается очередное звено растущей цепи РНК
из комплекса с матрицей и РНК-полимеразой. Высокая частота ошибок – 1 на 104
нуклеотидов, т.е. на пять порядков выше, чем при репликации.

16.

Терминация транскрипции
Последовательности ДНК, являющиеся сигналами
остановки транскрипции, называются
транскрипционными терминаторами
- Инвертированный GC-богатый повтор
в области терминатора приводит к
образованию петли на РНК;
- РНК-полимераза приостанавливается;
- Водородные связи АU-тракта
разрушаются;
- РНК транскрипт отделяется от
матрицы.

17.

Сравнение транскрипции у прокариот и эукариот
Прокариоты
Эукариоты
-Одна РНК-полимераза
(5 субъединиц)
-Три РНК-полимеразы
(более 10 субъединиц)
-Уровень транскрипции
определяется промотором
-Уровень транскрипции
определяется регуляторными
участками (энхансеры, сайленсеры)
-Связь с трансляцией
-Трансляция независима
от транскрипции
-Гены непрерывны
-Гены состоят из экзонов и интронов,
процессинг РНК
-Каждая мРНК обычно
кодирует несколько белков
-Каждая мРНК обычно
кодирует один белок

18. Пре-мРНК после синтеза (транскрипции) подвергается посттранскрипционным модификациям – процессингу (или созреванию пре-мРНК)

• Кэпирование
• Полиаденилирование
• Сплайсинг – только у эукариот – вырезание
неинформативных фрагментов (интронов) и
сшивание информативных (экзонов),
происходит исключительно в ядре

19. Процессинг РНК

Посттранскрипционные
модификации
Полиаденилирование
Кэпирование
Сплайсинг
Прокариоты
Эукариоты
+
+
(кроме вирусов)
+
-
+ (экзоны/интроны)

20.

Кэпирование мРНК
Кэпирование – процесс присоединения к 5'-концу пре-мРНК 7-метилгуанозина
через необычный для РНК 5',5'-трифосфатный мостик, а
также метилирование остатков рибозы двух первых нуклеотидов.
Ферменты метилтрансферазы

21.

Роль кэпирования:
–
–
–
–
–
участие в сплайсинге;
участие в процессинге 3'-конца мРНК;
экспорт мРНК из ядра;
защита 5'-конца транскрипта от экзонуклеаз;
участие в инициации трансляции.

22.

Функции поли(А)-хвоста
• увеличивает стабильность мРНК
• необходима для транспортировки мРНК из ядра в цитоплазму
• Влияет на сборку трансляционного комплекса

23. Полиаденилирование мРНК

• polyA увеличивает стабильность мРНК
• polyA необходима для транспортировки мРНК
из ядра в цитоплазму
• Влияет на сборку трансляционного комплекса

24.

Сплайсинг – процесс удаления интронов (участки, которые не кодируют
белки), а экзоны (участки, кодирующие белки) сшиваются и образуют единую
молекулу.
Сплайсинг катализируется крупным нуклеопротеидным комплексом –
сплайсосома , которая состоит из
- белков (snRNP, U1, U2, U3, U4, U5 и U6)
- малых ядерных РНК.