Патолого-анатомическая диагностика бактериальных инфекций. Антибиотикотерапия. Борьба с резистентностью микроорганизмов

1. «Патолого-анатомическая диагностика бактериальных инфекций. Антибиотикотерапия. Борьба с резистентностью микроорганизмов.»

Василий Афонюшкин

2. Патологоанатомический мониторинг

• Именно он основа оценки
эффективности антибиотикотерапии
• Лучше и эффективнее вместо 200-300
тыс. р/месяц оценивать встречаемость
реальных патологий
• Сэкономленные на серомониторинге
деньги лучше потратить на изучение
путей решения проблем

3. Патологоанатомический мониторинг нужен для отслеживания динамики инфекций, оценки эффективности новых схем и препаратов а не

для
ведения отчетности!
Вакцинация снижает заболеваемость более чем в
2 раза, но на рынке этой вакцины не будет

4. Bacillus cereus

Диагностика:
Мазки отпечатки из печени
и со слизистой кишечника
Рост на среде Мозеля
Объекты исследований:
корма, мясокостная мука,
печень, кишечник

5. Gallibacterium anatis

Диагностика:
1. ПЦР Primers G. anatisare 1133fgal (5‘TATTCTTTGTTACCARCGG-3‘) and 114r
(5‘- GGTTTCCCCATTCGG-3‘) [1]
2. FISH GAN850 (5′TTGCTTCGAGAGCCATAC-3′) [2]
1.
2.
https://www.omicsonline.org/open-access/gallibacteriumanatis-an-emerging-pathogen-of-poultry-birds-anddomiciled-birds-2157-7579-1000324.php?aid=72320
2 http://jcm.asm.org/content/41/11/5167.full

6.

Вакцины нет

7.

8.

9. Серологическая диагностика бактериальных инфекций на основе антигенов из культур выделенных на птицефабрике.

Реакция агглютинации с
флюоресцентно-меченным
антигеном.
• Можно сравнить разные
культуры бактерий
выделенные от больной
птицы по способности к
агглютинации
сыворотками крови
переболевшей птицы. Да,
критерий косвенный, но
это намного лучше
постановки диагноза –
стафилококкоз, только на
том основании, что
стафилококк лучше растет
на питательных средах и
чаще выделяется, чем
пастерелла

10. Mycoplasma synoviae

Инфекция Mycoplasma synoviae является заболеванием верхних
дыхательных путей кур и индеек.
В большинстве случаев инфекция M.synoviae встречается
бессимптомной; она может вызвать аэросаккулит при
совмещении с вирусными инфекциями, такими как птичий
парамиксовирус 1 (APMV-1) и инфекционный бронхит (Olson,
1984; Kleven, 2003). Реже заражение M. synoviae может
становиться системным, вызывая экссудативный синовит в
суставах и сухожильных влагалищах, и воспаление
синовиальной сумки (King et al ., 1973). В таких случаях, M.
synoviae может привести к значительным материальным
потерям в результате снижения эффективности производства
и выбраковки из-за аэросаккулита, синовита, воспаления
синовиальной сумки и сепсиса (Kerr & Olson, 1967; Olson &
Kerr,1967; King et al ., 1973; Timms, 1978; Kleven, 2003; Lockaby
& Hoerr, 1999).
Настоящий отчет описывает заражение M. synoviae у цыплят
бройлеров, страдающих системным повреждением,
включающим различные органы, с высоким уровнем
отбраковки при переработке.

11. Дифференциальная диагностика суставной формы микоплазмоза

12. Осложнения при бактериальном эндокардите – суставная форма

13. Дифференциальная диагностика суставных патологий

Дисхондроплазия
Бактериальный эндокардит
Перозис
Стафилококковые инфекции

14. Пастереллезы

• В настоящее время в РФ
превалируют хронические
формы пастереллезов
характеризующиес стертыми
клиническими признаками
На птицефабриках стационарно
неблагополучных по
пастереллезу отмечается
наличие ассиметричных
некрозов головки бедренной
кости
У взрослой птицы повышается
частота овариитов

15. Факторы определяющие эффективность антибиотикопрофилактики пастереллезов

60
50
гол.
40
общая
смертность
30
гибель от
пастереллеза
20
10
Средние уровни
инфицированности пастереллами
в различные возрастные периоды,
%
0
-10 10
20
30
40
50
70
дн.
Динамика инфицирования
пастереллезом по результатам
ПЦР
120
в 42 дн
в/м Амокс.
1 игла на 1000гол.
газация
в 63 дн
в/м Гентамицин
1игла на 1000 гол.
70%
(40%-100%)
80
газация
100%
100
в 18 дн
в/м Гентамицин
1 игла на 1000гол.
в 25 дн
в/м Амокс.
1 игла на 1000гол.
газация
25%
(0%-50%)
газация
40
газация
60
газация
20
20%
выпойка антибиотика
выпойка антибиотика
газация
выпойка антибиотика
0%
0
1дн
-20
2дн
3дн
4дн
5дн
10дн
16дн
18дн
20дн
23дн
25дн
27дн
28дн
29дн
30дн
31дн
37дн
40дн
42дн
47дн
50дн
54дн
55дн
56дн
57дн
58дн
60дн
63дн

16. Предрасполагающие факторы повышающие инцидентность пастереллезов

• МПВИ
• Широкое использование инъекционных
обработок
• Наличие клещей, пухоедов, клопов
• Дисбиозы кишечника и применение споровых
пробиотиков в период роста заболеваемости
• Снижение кратности обмена воздуха, высокий
уровень CO2 в воздухе или низкий уровень
гемоглобина в крови

17. Клиническая эффективность антибиотиков

Фторхинолоны
Нитрофураны
Амоксициллин, ампициллин
Антибиотики тетрациклинового ряда
Важное значение имеет
массированное применение
антибиотиков, не обязательно
Массовая гибель от сепсиса обычно
большие дозы но больше кратность и связана не с ростом инфицированности,
длительность курсов
а с возрастным изменением
чувствительности птицы к токсину
поэтому антибиотики малоэффективны
но использование антитоксических
средств дает клинический эффект

18. Дифференциальная диагностика респираторного микоплазмоза: орнитоз

19. Ornithobacterium rinotracheale

Выявление данного микроорганизма
это не повод ставить диагноз –
орнитобактериоз!!!

20. Подбор антибиотиков при Орнитобактериозе

Рис. 1 Рост O.rinotracheale в присутствии тилмикозина и
флавофосфолипола (контроль, не подавляет
размножение Гр- бактерий)
Примечание: чем раньше появляется флюоресценция
(на более раннем цикле, тем больше бактерий)

21. Ситуации когда не все антибиотики полезны: Энтерококки Колибактериозы Кандидозы Клостридиозы

22. Что такое молекулярная эпизоотология и почему она нужна для выяснения путей заражения?

В данной ситуации мы использовали анализ
микросателлитной ДНК с помощью ПЦР. Однако, во всем
мире, кроме РФ, золотым стандартом идентификации
штаммов сальмонелл является метод RFLP-PFGE. В России
такое
ночто
не глобальным
используется…
Тезис оборудование
4. Есть основанияесть,
считать
фактором
определяющим эпизоотическую ситуацию по сальмонеллезу является
вертикальный путь заражения сальмонеллами от племенной птицы.
Рис. 1. Результаты типирования
S. enteritidis, выделенной
на разных птицефабриках с помощью
VNTR-ПЦР:
1. Голубь из кормоцеха. 2. Цыпленокбройлер. 3. Суточный цыпленок
до поступления на птицефабрику
Рис. 2. Штаммы сальмонелл,
выделяемые до (№ 1-7) и после (№ 8-23)
смены кросса птицы на птицефабрике.
Мультилокусное VNTR-типирование

23.

Что является фактором риска при
заражении людей S. Infantis – потребление
продуктов яичного происхождения или
цыплят-бройлеров?
Как следует из данного исследования – основной
фактор риска несушка!!! Теоретически возможно
заражение в процессе приготовления продуктов
бройлерного птицеводства (размораживание не в
горячей воде). И это несмотря на то, что уровень
инфицированности цыплят – бройлеров данной
сальмонеллой драматически выше, чем у несушки.
Тезис 5. Крайне сомнительно, что и куры –несушки и цыплята-бройлеры вносят одинаковый вклад в
эпидемиологическую ситуацию по сальмонеллезам. Но, если это не так – следует определится с
направлением противосальмонеллезных мероприятий – или несушка или бройлеры!!!!

24. Видовой состав микробиомов представителей сем. Lactobacillaceae от птицы с птицефабрик обладающих разным уровнем благополучия в

отношении Salmonella spp.

25. Дисперсионный анализ (ANOVA) результатов сокультивирования Salmonella enterica с различными штаммами Lactobacillaceae

"Var10"; LS Means
Current effect: F(6, 24)=25,566, p=,00000
Effective hypothesis decomposition
Vertical bars denote 0,95 confidence intervals
35000
30000
25000
Var9
20000
15000
10000
Концентрации различных штаммов сальмонелл
(ГЕ/5 мкл.) при сокультивировании с различными
штаммами Lactobacillaceae (a-g).
Примечание: Lactoвасillus А - G штаммы Okt, NB1140,
NBP1, NBP181, LGK2710, 2SGI 8037,
3SGI8037
Антагонизм есть
5000
0
-5000
a
b
c
d
Var10
e
f
g

26. А всегда ли применение антибиотиков вызывает дисбактериоз? Процент выделяемых изолятов лактобактерий с высоким и низким уровнем

чувствительности к исследуемым антибиотикам

27.

Примеры реинфицирования кишечника микроорганизмами рода
Salmonella при постантибиотическом дисбактериозе, снижение
интенсивности реинфекции с помощью челночных схем
120
% инфицированности
% инфицированности
100
100
16
80
14
60
60
12
10
40
8
20
0
% инфицированности
6
0
до опыта
4
после антибиотика
антибиотик + пребиотик
Рис. 1 инфицированность желудочно
кишечного тракта при использовании
антибиотика широкого спектра действия в
моноварианте и в сочетании с пребиотиком
2
0
до эгоцина
сразу после
через 7 дней
Рис.2 Динамика инфицированности клоаки
кур до и после использования эгоцина.

28. Проблемы связанные с антибиотикорезистентностью

• Рост числа антибиотикорезистентных штаммов разных видов
м.о.– как глобальная проблема? А насколько это правда?
• Полирезистентность возбудителей нозоомикальных инфекций
• Резистентность возбудителей кишечных инфекций
• Резкое снижение темпов разработки новых антибиотиков -кто
виноват - ученые или бизнесмены?
• Рост потребления антибактериальных соединений в сельском
хозяйстве, медицине, пищевой промышленности, парфюмерной
промышленности хорошо это или плохо?

29. Что такое эффлюкс?

Антибиотикочувствительность сальмонелл с
эффлюксом и без эффлюкса, зоны задержки роста
(n=20), мм
Оценка эффлюкса у культур
сальмонелл в тесте с
бромистым этидием
Изменение антибиотикорезистентности после контакта с
цитринином, М+SD мм
Схема эффлюкс
помпы

30.

Эффлюкс – наиболее универсальный механизм защиты бактерий от антибиотиков и не только
А
Б
Схема строения эффлюкс-помпы (А) [1.] и путей регуляции эффлюкс-помп у сальмонелл (Б)
Примечание: взаимодействие антибиотика, с рецептором MarR запускает экспрессию гена MarA,
которая, активирует эффлюкс-помпы сальмонелл, (Schmidt, S., P. Heisig, 2007)Синтез
транскрипционного фактора SoxS повышается в присутствии активных форм кислорода, Что
запускает экспрессию широкого спектра генов, включая гены эффлюкс-помп [3].
1.Klaas M. Pos,Trinity revealed: Stoichiometric complex assembly of a bacterial multidrug efflux pump //PNAS vol. 106
no. 17 . Pos, 6893–6894, doi: 10.1073/pnas.0902837106
2.Schmidt, S., P. Heisig. Potential of fluoroquinolones to induce the expression of the acrAB efflux pump and the global
regulator marA in Salmonell Hadar. Vortrag. 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases,
Nizza, Frankreich. 2006. , –P 48-54
3.Ma D, Alberti M, Lynch C, Nikaido H, Hearst J. E. The local repressor AcrR plays a modulating role in the regulation
of acrAB genes by global stress signals.// Mol Microbiol. 1996;19:101–112.
Основной тезис – и вовсе не факт, что только использование антибиотиков
ведет к накоплению резистентных микроорганизмов… надо искать.

31. Что делать с полирезистентными сальмонеллами и кишечной палочкой?

Молекулярная эпизоотология кишечной палочки
Зоны задержки роста к штамму S.enteritidis
№25, мм
Дендрограмма
группировки
культур
кишечной палочки и сальмонеллы по
результатам фаготипирования. Цветная шкала
– результат разделение на кластеры. Первая цифра
– номер ветви, вторая цифра – номер кластера

32. Можно ли найти замену антибиотикам?

Применение противосальмонеллезного бактериофага. Процент
инфицированности

33. Основы профилактики антибиотикорезстентности бактерий

Нельзя два курса подряд использовать антибиотик одной и той же группы
Санразрыв и дезинфекция должны обеспечивать блокирование передачи как патогенных
микроорганизмов, так и генов антибиотикоустойчивости
Замена антибиотиков альтернативными антибактериальными средствами, токсичные корма
также могут спровоцировать полирезистентность
Кишечная микробиота самый опасный источник генов антибиотикоустойчивости. Поэтому
профилактика дисбиозов и реинфекций важна (Применение челночных схем
антибиотикоретрапии, гомопробиотики, пребиотики).
При полном отсутствии антибиотикочусвтивтельности целесообразно применение
бактериофагов
Разные вирусные инфекции провоцируют разные бактериальные вторичные инфекции.
Иногда проще наладить профилактику вирусных инфекций, чем применять длительные
курсы антибиотикотерапии
Мониторинг качества антибиотиков. Мониторинг развития антибиотикорезистентности
Отмена комбинированных антибиотиков – снижение риска возникновения
полирезистентности в несколько раз

34. Что необходимо для повышения эффективности противосальмонеллезных мероприятий в среднесрочной и долгосрочной перспективе?

Селекция на устойчивость кур к
сальмонеллам-микоплазмам
Если обнаружен новый серотип –
вакцины из местных штаммов
Возможность исследования
биоматериала с племрепродукторов за счет
птицефабрик-клиентов
Упрощение процедуры регистрации
противосальмонеллезных
бактериофагов
Создание банка данных по штаммам
Более широкое применение
сальмонелл
кормовых антибиотиков не
использующихся в медицине
Сравнительные испытания
различных
Двухуровневая система типирования
противосальмонеллезных схем
выделенных культур гос.вет. cлужба ->
НИИ
ЧТО еще?......

35. Рейтинговый анализ эффективности проведения разных экспериментов, нацеленных на снижение инфицированности цыплят сальмонеллами

36.

Синегнойная палочка и ее родственники
Картина
дисбиоза
требует
дифференцир
овки диагноза
Таблица 1. Концентрация лактобактерий при
выпаивании
культуральной
жидкости
P.aeruginosa, log10 кое/гр
Синегнойная
палочка
светиться
в
ультрафиолетовых
лучах,
рост
на
селективной среде BioRad для выделения
Pseudomonas aeruginosa
Результаты электрофореза в 1.8% геле агарозы
продуктов ПЦР и продуктов их рестрикции
рестриктазой Taq I

37. Микробиоценотический уровень защиты от лактамных антибиотиков

38. Распространенность гена mphA изучали в популяциях сельскохозяйственной птицы в частности в пробах тотальной ДНК кишечных

микробиоценозов
Праймеры со следующими последовательностями
5-AAATCTGGCCACGACGAATC-3
5-AATGCTCAAGAATCGCCTGC-3
Размер ампликона 366п.н. (пар нуклеотидов)
Средняя частота встречаемости макролидфосфорилазы типа А
- 21% у цыплят бройлеров
Мы обнаружили этот ген у единичных штаммов сальмонелл
серотипов Dublin, Infantis

39. Подавление факторов патогенности бактерий (подвижность). Кормовые антибиотики зло или…?

Примеры
траекторий
движения
бактерий
Средние концентрации одного
из кормовых антибиотиков
ингибирующие
рост
и
подвижность бактерий
Строение жгутика
Подавление подвижности P. aeruginosa на
среде MIO при различных
концентрациях (штамм P. aeruginosa 668)

40. «Экзотические» схемы антибиотикопрофилактики и терапии

Челночные схемы
Антибиотик +пробиотик
Антибиотик вместо пребиотика
Антибиотик для терапии вирусных
миокардитов и пневмоний
• Антибиотик для санации мяса (вместо
антисептиков)

41. Примеры ассоциативных исследований

Как доказать – какой из обнаруженных инфекционных
агентов вызывает проблему?
Большое количество птичников, в сочетании с отсутствием возможности пресекать циркуляцию
инфекционных агентов методом пусто-занято, обеспечивают хорошую воспроизводимость
инфекционных процессов, что позволяет экстраполировать данные с нескольких птичников на
все остальное поголовье.
Эта же проблема позволяет одновременно отбирать образцы из птичников с разными
показателями (сохранность, продуктивность) и сравнивать их по результатам лабораторных
исследований.
Таким образом, следует разделять серологические
исследования (а также ПЦР и биохимии) на
мониторинговые, скрининговые и ассоциативные.
Примеры ассоциативных исследований
Рис. 1 Уровни альбумина в крови в двух группах
птичников с наибольшей и наименьшей сохранностью.
На фоне астровирусного нефрита цыплят
Рис. 2. Инфицированность селезенки ВБМ у
цыплят с дерматитами и без дерматитов

42.

Быть носителем возбудителя сальмонелл и микоплазм эволюционно
выгодно!!! Следует ожидать накопления родительских форм генетически
предрасположенных к бессимптомному носительству (сальмонелл,
микоплазм, хламидий, возбудителя гепатоспленомегалии, L. salivarius)
Хорошая репродукция,
высокая инфицированность
Заражение и снижение количества
жизнеспособных поросят
Источник заражения остального
поголовья свиноматок,
источник зараженных поросят
Численность птиц предрасположенных к заражению, но устойчивых к заболеванию снижается,
инфицированность растет
Вывод – диагностика и мероприятия по ликвидации
должны и начинаться с родительских форм и
молодняка финального гибрида
Основной тезис – селекционерам стоит начать думать о селекции на устойчивость к
инфицированию, Salmonella, Mycoplasma т.е. возбудителям вертикально
передающихся инфекций и поражающих молодняк

43.

44.

45. И еще виноваты во всем..

46. заходим на производство

47.

1.
2.
3.
Дезинфекция по грязному,
мойка, заключительная дезинфекция
4.
5.
Дезинфекция по
грязному
Мойка
Заключительная
дезинфекция
Биопауза (иногда
удаление
дезинфектанта
повторной мойкой)
Дезинфекция в
присутствии птицы,
санация системы
водопоения в
присутствии птицы
Санация линий кормораздачи
в птичниках и санация
норий и шнеков на ко
мбикормовых заводах
Добавление споровых
пробиотиков в моющие
средства

48. Концепция максимальной микробиологической чистоты в птичнике перед заселением

Пол 5х103 кое/см2
Стены 5х102 кое/см2
Отсутствие сальмонеллы
Отсутствие кишечной палочки
Микробиологический мониторинг в
точках риска
Нужно помнить – санитарное
благополучие определяется САМЫМ
загрязненным участком а не самым
чистым
Концепция Нурми

49. Профилактика передачи генов антибиотикорезистентности между турами или – не все дезинфектанты одинаково полезны

Результаты ПЦР в режиме реального времени
Примечание: 1 – интактные контроли (ДНК
сальмонелл), 2 – ДНК выделенная из сальмонелл
обработанных экоцидом, 3 -ДНК обработанная
экоцидом
Подавление устойчивости к ампициллину путем
разрушения плазмид с геном лактамазы
Результаты
трансформации
плазмидой
pBlueskript,
подвергнутой
воздействию
препаратов Экоцид (1) и HPPI (2), культуры
E.coli XL Blue

50. СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ