Определение молекулярной массы белка актина методом электрофореза по Лэммли

1.

КУРЧАТОВСКАЯ
ШКОЛА
Определение молекулярной массы белка актина
методом электрофореза по Лэммли
Введение
Авторы работы: Варганкина В. Д.
В разных областях биологии и медицины очень важно
знать молекулярную массу каких - либо веществ, в том
числе и белков. Это необходимо для проведения
исследований и опытов. Для определения молекулярной
массы белков существуют различные методы, в том числе
метод электрофореза. Этот метод является простым и
эффективным для определения молекулярной массы
белков.
В своей работе я решила испробовать эффективность
данного метода на примере определения молекулярной
массы белка актина, который встречается во всех клетках
нашего организма.
Руководитель: Нефёдова В. В.
Цель
Определить молекулярную массу мышечного белка актина
методом электрофореза по Леммли.
Задачи
-Найти и проанализировать информацию о строении
мышечных белков.
-Изучить метод электрофореза в полиакриламидном геле в
присутствии додецилсульфата натрия (по Леммли).
-Провести определение молекулярной массы актина.
Белок актин
Актин - глобулярный белок, состоящий из одного полипептида,
который полимеризуется с другими молекулами актина и образует
две цепи, обвивающие друг друга. Белок актин содержится в
тонких филаментах скелетных мышц и цитоскелете клеток.
По данным электронной микроскопии было обнаружено, что
актиновые филаменты состоят из двух цепей глобулярных
молекул, диаметром 4 нм и образующих двойную спираль (рис. 1),
на каждый виток которой приходится 13,5 молекулы. Данные цепи
составляют остов тонких филаментов скелетных мышц, которые
помимо актина содержат миозин и другие белки [1,3].
Ри с. 1. Схем ати ч ное и зображ ени е
белка акти на.
Р и с. 2 . С х е м а п о л и м е р и з а ц и и и
д е п о л и м е р и з а ц и и а к ти н а .
Актин можно выделить путем экстракции мышечной ткани
разбавленным солевым раствором. В результате обработки
происходит расщепление актиновых филаментов на глобулярные
субъединицы, так называемый глобулярный актин (G-актин), к
которому присоединен ион кальция и одна молекула АТФ. При
полимеризации белка (рис.2) происходит отщепление концевого
фосфата молекулы АТФ и образование фибриллярного актина (Fактин).
Методы:
Для определения молекулярной массы белка актина был
использован
метод
электрофореза
по
Лэммли,
заключающийся в разделении заряженных молекул в
электрическом поле. Весь процесс проходит в камере для
электрофореза, заполненной всеми заготовленными ранее
материалами (полимаеризованный гель ПААГ с белками в
лунках)(рис 9).
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ГОРОДА МОСКВЫ
«КУРЧАТОВСКАЯ ШКОЛА»
Москва, улица Маршала Конева, дом 10. Тел: (499) 194-10-44. E-mail: [email protected]
А
Б
Цель и задачи работы
Материалы и методы
Результаты
Был проведен электрофорез белков по
методу Лэммли. Пробы наносили в лунки ПААГ
АКТИН
в соответствии с таблицей 1 (рис 7).
Для того чтобы выяснить молекулярную
массу представленного образца актина были
использованы белки с уже известной
молекулярной массой (белки маркеры). После
окончания электрофореза была измерена
длина пути, который прошел каждый из белков
АКТИН
– маркеров. Следует отметить, что белок маркер овальбумин прошел 11 мм пути. Такой
же путь прошел и актин. После этого была
построена калибровочная кривая при помощи
программы Excel, и по ней была определена
Р и с. 6 С к ан ы гелей . А . гел ь 1 , н о м ер а д о ро ж ек со о т в ет ст в ую т
т аб ли ц е 4, Б . гель 2 , н о м ера до ро ж ек со о т в ет ст в ую т т аб ли ц е н а ри с
масса актина (рис. 15).
7. П о ло ж ен и е ак т и н а п о к азан о ст релко й .
Молекулярная масса актина оказалась равной 46,7 кДа ( значения, указанные в
литературе — 42 кДа).
Расчеты:
Log10 (45) = 1,7 (логарифм молекулярной массы овальбумина)
Log 10(молекулярная масса актина) = -0.0245*l +1.9384 (l- длина пути; l=11)
Log10= 1,7, Mr (актин) = 101,7
Mr (актин) = 46,7 кДа или 45700 г/моль
Актин в мышцах и регуляция их работы
Мышца, важная часть опорно-двигательного аппарата представляет
собой плотный орган, имеющий в своем составе активную часть - брюшко,
состоящее из мышечной ткани, и сухожильные концы. Снаружи мышца
покрыта фасцией. Пучки волокон отделены друг от друга
соединительнотканными прослойками (перимизий). Между каждым
мышечным волокном в свою очередь также имеется прослойка –
эндомизий. В состав каждого мышечного волокна входят миофибриллы и
образующие их актиновые и миозиновые филаменты (Рис. 3.)
Ри с. 3. Строен и е м ы ш ц ы : от ф асц ии д о ф и лам етов
Для выполнения своей функции мышце
необходимы
механизмы
регуляции,
заставляющие скользить тонкие и толстые
нити микрофиламентов друг относительно
друга. «Скольжение» нитей вызывается
изменением концентрации ионов кальция
в межфибриллярном пространстве, что в
свою очередь вызвано электрическими
импульсами [1].
Материалы:
Р и с .8 К а л и б р о в о ч н а я п р я м а я д л я о п р е д е л е н и я м а с с ы б е л к а и у р а в н е н и е
к а л и б р о в о ч н о го гр а ф и к а
№ Дорожки
Название
образца
Гель № 1
Гель №2
1
-
Белки-маркеры окрашенные, 6
мг
2
Белки-маркеры
неокрашенные, 2 мг
Белки-маркеры окрашенные, 4
мг
3
-
Белки-маркеры окрашенные, 2
мг
4
Актин, 4 мг
Актин,4 мг
5
Актин, 6 мг
Актин, 6 мг
6
Актин, 8 мг
-
7
Актин, 10 мг
Актин, 6 мг
8
Актин, 12 мг
Актин, 2 мг
9
Актин, 14 мг
Белки- маркеры окрашенные, 4
мг
10
-
-
Рассмотрим
механизм
мышечного сокращения с
участием актина и
миозиона.
Сокращение
волокон
мышц
является
результатом цепи реакций [6]
(рис.4):
2 . А Т Ф -а з а г о л о в о к м и о з и н а
ги д р о л и з у е т А Т Ф н а А Д Ф , ч т о
вы зы вает
а ллостери ч е ск и е
и з м е н е н и я в м и о зи н о в о й го л о в к е
4 . Ускор е ни е в ы бр оса п ро д ук тов из
а к т и в н о го ц е н т р а м и о з и н а . Г о л о в к а
м и ози на
н а п р я га е т с я ,
м еняя
к онф орм а ц и ю , и д ей ств уе т под обно
в е сл у.
П рои сход и т
перем ещ ени е
м и о з и н о в о го
ф и лам ента
вд оль
а к т и н о в о го ф и л а м е н т а .
3.
Головк а
м иози на
обра зуе т нов ы й м ости к с
сосед ней
м ол е к ул ой
акти на
Р и с. 4 М еха н и зм со к р а щ ен и я м ы ш ечн ы х во ло к о н
Р и с. 1 1 К а м е р а д л я ге л е й (1 ) с уж е в ст а в л е н н ы м и гр е б е н к а м и
( 2 ), к о т о р ы е б у д у т и з в л е ч е н ы п о с л е п о л и м е р и з а ц и и г е л е й
Актин в составе цитоскелета клеток
Цитоскелет клетки – это совокупность нитевидных белковых
структур –микротрубочек и микрофиламентов, в состав которых
входит актин,
составляющих опорно-двигательнуюсистему
клетки [5]. Цитоскелетом обладают только клетки эукариот, в то
время как у клеток прокариот он отсутствует. На рисунке 5
представлен общий план строения составляющих цитоскелета
клетки, куда входят: микрофиламенты, микротрубочки и
промежуточные филаменты.
Ри с. 9 З а полне нна я к а м ера д ля эле к троф оре за с
п од к л ю ч е нны м к не й и сточ ни ко м ток а
Р и с 1 0. Р еакти вы и о б о р удо ван и е
Рис. 7 (таблица 1)
Р и с . 1 2 И с то ч н и к то к а « a m e rs h a m p h a rm a c ia
b io te c h »
Электрофорезом по методу
Леммли можно определить
молекулярную
массу
исследуемого белка, для этого
проводят
электрофорез
в
присутствии белков с известной
молекулярной массой. После
электрофореза идентифицируют
белки маркеры, измеряют
расстояние, которое прошел
белок- маркер в геле, и строят
график в зависимости от
лагарифма их молекулярной
массы. Далее, используя этот
график,
определяют
массу
неизвестного белка.
Выводы
-Был освоен метод определения молекулярной массы белков
с помощью электрофореза по Леммли.
-Определена молекулярная масса актина, которая составила
46,7 кДа.
1 . С в я зы в а н и е А Т Ф с м и о зи н о в о й го л о в к о й и
о т д е л е н и е е е о т а к т и н о в ы х н и те й
5. П овторени е ц икла. Ц и кл
повторяется
до
и з р а с хо д о в а н и я в се го А Т Ф
-Реактивы для Разделяющий ПААГ15% и концентрирующий ПААГ- 6%,
белки- маркеры, актин (рис. 10)
-Оборудование:
камера
для
полимеризации геля BioRad (рис. 9),
камера
для
проведения
электрофореза Biorad Mini-protean
Tetra Cell (рис. 11), источник тока
Amersham Pharmacia Biotech (рис.
12).
Перспективы/Список литературы
Р и с. 5 О б щ и й п л ан стр о ен и я со ставляю щ и х ц и то ск ел ет
1. Гусев Н. Б. (2000) «Молекулярные механизмы мышечного
сокращения», Соросовский образовательный журнал № 8
2. www.chem.msu.su
3. www.humbio.ru
4. Теремов А. В., Петросова Р. А. – Биология 10 класс, учебник
5. www.sbio.info
6. www.mscience.ru
7. М. И. Сафронова, Н.Н. Зайцева «Основы практической биохимии
белка»