Методы разделения белковых смесей. Хроматография

1. Методы разделения белковых смесей Хроматография

Лекция 4

2. План лекции

1.
2.
3.
4.
Методы разделения белковых смесей
Основные принципы хроматографии
ВЭЖХ
Инструментальное обеспечение

3. Методы разделения белковых смесей

1. Высокоэффективная жидкостная хроматография
разделение по заряду, молекулярной массе, степени гидрофобности,
специфическом взаимодействии с носителем
2. Электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата
натрия
разделение по величине молекулярных масс
3. Изоэлектрофокусирование
разделение по величине изоэлектрических точек
4. Двумерный электрофорез
изоэлектрическая точка+молекулярная масса
5. Иммуноблоттинг (Вестерн-блоттинг) - визуализация
детекция при помощи антител

4. Высокоэффективная жидкостная хроматография

5. Хроматография

Хроматография - динамический метод анализа,
основанный на многократно повторяющихся
процессах сорбции и десорбции.
А+В
А
В
Неподвижная фаза – твердое вещество или
иммобилизованная жидкость
Подвижная фаза (элюэнт) – жидкость или газ

6. История

1900
Метод впервые применен М. Цветом
1910—1930
Метод не развивался
1931
Р. Кун, А. Винтерштейн и Е. Ледерер при помощи хроматографии выделили из
каротина α и β фракции в кристаллическом виде, чем продемонстрировали
препаративную ценность метода.
1942
А. Дж. П. Мартин и Р. Л. М. Синг разработали новую разновидность
хроматографии, в основу которой легло различие в коэффициентах
распределения разделяемых веществ между двумя несмешивающимися
жидкостями. Метод получил название «распределительная хроматография».
1947
Т. Б. Гапон, Е. Н. Гапон и Ф. М. Шемякин разработали метод «ионообменной
хроматографии».
1952
Дж. Мартину и Р. Сингу была присуждена Нобелевская премия в области
химии за создание метода распределительной хроматографии.

7. Виды хроматографии

Критерии классификации
способ ввода пробы;
агрегатное состояние фаз;
механизм взаимодействия аналита с неподвижной фазой;
назначение.

8. По способу введения пробы

Элюентная хроматография (проявительная)
• Наиболее часто используемый вариант проведения аналитической
хроматографии. Анализируемую смесь вводят в поток элюента в виде
импульса . В колонке смесь разделяется на отдельные компоненты,
между которыми находятся зоны подвижной фазы.
Фронтальная хроматография
• Смесь непрерывно подают в колонку, при этом на выходе из колонки
только первый, наименее удерживаемый компонент можно выделить в
чистом виде. Остальные зоны содержат 2 и более компонентов.
Родственный метод — твердофазная экстракция (сорбционное
концентрирование).
Вытеснительная хроматография
• В колонку после подачи разделяемой смеси вводят специальное
вещество-вытеснитель, которое удерживается сильнее любого из
компонентов смеси. Образуются примыкающие друг к другу зоны
разделяемых веществ.

9. ТФЭ (SPE)

Твердофазная экстракция, ТФЭ — разделение твердофазных смесей с
использованием твердых сорбентов. В аналититческой химии используется для
пробоподготовки. Целевое вещество для анализа (аналит) сорбируется из
матрицы и вымывается растворителями (экстрагируется). ТФЭ сокращает время
пробоподготовки, уменьшает расход растворителей и поднимает точность
анализа.
Колонки для ТФЭ
Устройства для автоматизации ТФЭ

10. ТФЭ

Назначение ТФЭ:
очистка пробы от нежелательных примесей,
концентирование компонентов пробы,
перевод компонентов пробы на другую матрицу.
Основные методы ТФЭ:
одностадийная очистка, когда все нежелательные компоненты пробы собираются
на сорбенте, а аналит собирается
двухстадийная очистка и концентрирование, когда проба наносится на патрон
вместе с нежелательнимы примесями, а потом с помощью более сильного
элюента смывается аналит. Все нежелательные примеси остаются на сорбенте.
трехстадийная очистка и концентрирование: на первом этапе все компоненты
наносятся на патрон, на втором смываются легкие нежелательные компоненты,
на третьем смывается аналит. Все тяжелые нежелательные примеси остаются на
сорбенте.

11. По агрегатному состоянию фаз

• Газовая хроматография
– Газо-жидкостная хроматография
– Газо-твёрдофазная хроматография
• Жидкостная хроматография
– Жидкостно-жидкостная хроматография
– Жидкостно-твёрдофазная хроматография
– Жидкостно-гелевая хроматография
• Сверхкритическая флюидная хроматография

12. По механизму взаимодействия

Распределительная хроматография
Ионообменная хроматография
Адсорбционная хроматография
Эксклюзионная хроматография
Аффинная хроматография
Осадочная хроматография
Адсорбционно-комплексообразовательная
хроматография

13. Распределительная хроматография

хроматографический метод, при котором неподвижная
(стационарная)
фаза
химически
связана
с
поверхностью неподвижного носителя.
Подвижной фазой является жидкость (LLC — англ. liquid
liquid chromatography), которая служит растворителем,
или газ (газовая хроматография). Разделение
происходит
за
счёт
различия
полярности
разделяемых веществ.
Частным случаем распределительной хроматографии
является обращённо-фазная хроматография.

14. Ионобменная хроматография

хроматографии позволяет разделять ионы и полярные молекулы, на основании
зарядов разделяемых молекул.
• Данный вид хроматографии позволяет разделить практически любые
заряженные молекулы, в том числе: крупные — белки, малые—молекулы
нуклеотидов и аминокислот. Часто ионообменная хроматография используют
как первый этап очистки белков.
Принцип ионообменной хроматографии
• Ионообменная хроматография позволяет разделить молекулы, основываясь на
ионных
взаимодействиях.
Неподвижная
фаза
имеет
заряженные
функциональные группы, которые взаимодействуют с анализируемыми
ионизированными молекулами противоположного заряда. Этот вариант
хроматографии классифицируется на два типа — катионную и анионную
ионообменную хроматографию:
• Катионная ионообменная хроматография задерживает положительно
заряженные катионы, так как неподвижная фаза имеет отрицательно
заряженные функциональные группы, например, фосфат (PO43−).
• Анионная ионообменная хроматография задерживает отрицательно
заряженные анионы, так как неподвижная фаза имеет положительно
заряженные функциональные группы, например, +N(R)4.

15. Адсорбционная хроматография

вид хроматографии, основанный на способности твёрдого
вещества — неподвижной фазы — сорбировать примеси,
находящиеся в подвижной фазе.
Эффективность разделения примесей пропорциональна их
величинам адсорбции при условиях эксперимента.
Процесс взаимодействия может сопровождаться химическим
взаимодействием примесей с неподвижной фазой, то есть
хемосорбцией.

16. Эксклюзионная хроматографии (гель-фильтрация)

молекулы веществ разделяются по размеру за счёт их разной способности проникать в поры
неподвижной фазы.
• Первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (бо́льшей молекулярной массы),
способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят
вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры.
! при гель-фильтрации стационарная фаза остается химически инертной и с разделяемыми
веществами не взаимодействует.
Разделение феррицианида калия и
Принцип разделения
голубого декстрана (сефадекс G25)

17. Эксклюзионная хроматографии (гель-фильтрация)

Объем образца лимитирующий для качества хроматографии
o Аналитическое разделение: не более 0,1% Vc
o Препаративное разделение: не более 8-10% Vc
Сорбенты
Низкого давления
агароза,
декстран,
полиакриламид,
сефадекс,
сефакрил,
сефароза,
супердекс.
Высокого давления
полиметакрилат,
полистирол,
силикагель

18. Аффинная хроматография

(от
лат.
affinis
–
родственный)
(биоспецифич. хроматография, хроматография по сродству),
метод очистки и разделения белков, основанный на их избират.
взаимодействии с лигандом, ковалентно связанным с
инертным носителем.
В кач-ве лигандов используют соед., взаимод. к-рых с
разделяемыми в-вами основано на биол. ф-ции последних.
Что связывается с носителем?
Субстраты,
Ингибиторы
Коферменты
Антитела
Катионы металлов –
(рекомбинантные белки).
метало-хелатная
хроматография

19. По назначению

аналитическая (динамический диапазон)
препаративная (10 мг – 10 г)
промышленная (тонны)

20. ВЭЖХ

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
High performance liquid chromatography (HPLC)
Инструментальная реализация хроматографических методов (Csaba Horváth)
Один из эффективнейших методов разделения сложных смесей веществ, широко
применяемый как в аналитической химии, так и в химической технологии. Основой
хроматографического разделения является участие компонентов разделяемой смеси в
сложной
системе
Ван-дер-Ваальсовых
взаимодействий (преимущественно межмолекулярных) на границе раздела фаз. Полученные
простые смеси анализируются затем обычными физико-химическими методами или
специальными методами, созданными для хроматографии.

21. ВЭЖХ Милихром

22. ВЭЖХ HP

23. ВЭЖХ Люмекс

24. ВЭЖХ Чешский прибор

25.

AgilentAgilent
1290 Infinity
ВЭЖХ
Technologies

26.

27. Основные узлы хроматографа

Дегазатор подвижной фазы
Насос высокого давления + градиентный
смеситель
Система инжекции (автосэмплер)
Колонка
Детектор
Коллектор фракций

28.

Схема хроматографа
(1) Резервуары для растворителей (2) дегазатор, (3) Градиентный клапан,
(4) смеситель, (5) насос высокого давления, (6) «инжекция», (6')
«загрузка», (7) петля, (8) предколонка, (9) аналитическая колонка, (10)
детектор (IR, UV), (11) устройство управления (компьютер), (12) резервуар
для отходов или коллектор фракций.

29. Подвижная фаза

o Обращеннофазовая хроматография
метанол
ацетонитрил
вода
ТГФ
o Параметры
вязкость
полярность
смешиваемость

30. Насос

Насос - обеспечивает стабильный поток подвижной фазы через колонку под
высоким давлением
Градиентный смеситель – обеспечивает градиент концентрации
растворителя
Режимы:
изократический
Состав
ПФ
не
изменяется;
градиентный смеситель не нужен
градиентный
Состав
ПФ
изменяется,
увеличивая силу элюэнта;
требуется градиентный смеситель

31. Инжектор

Назначение – дозированный ввод образца в колонку
Дозирующая петля
Работа шестипортового инжектора

32. Колонка

Геометрический объем колонки, Vc - внутреннее пространство пустой колонки.
Свободный объем, Vo - часть объема колонки, не занятая сорбентом.
Длина (высота) колонки, внутренний диаметр колонки, размер частиц сорбента, вид
сорбента.

33.

Сертификат качества на колонку

34. Требования к сорбенту

1. колоночный материал должен обладать достаточной
прочностью и жесткостью, мало зависящей от наличия и состава
элюента в колонке.
2. сорбент должен обладать достаточно развитой однородной
поверхностью и узким фракционным составом частиц.
3. сорбент не должен вступать в необратимые химические
взаимодействия как с компонентами элюента, так и с разделяемой
пробой.

35. Сорбенты

36. Виды детекторов

ультрафиолетовый (УФ, UV)
диодноматричный (PDA)
рефрактометрический
флуоресцентный
кондуктометрический
детектор радиоактивности
масс-спектрометрический (МС, MS)

37. Детекторы

38.

Хроматография сложной смеси веществ
(парфюмерная композиция)

39. Параметры

tM
время
удерживания
несорбируемого соединения;
tR1 и tR2 - абсолютные времена
удерживания компонентов 1 и 2.
Высота пика, h - расстояние от
максимума
пика
до
его
основания, измеренное вдоль
оси отклика детектора.
Нулевая (базовая) линия хроматограммы - линия, соответствующая нулевой
концентрации анализируемых веществ в элюате.
Шум - помехи, статистические флуктуации нулевой линии хроматограммы. Уровень шума
складывается из статистических флуктуации всех параметров, принимающих участие в
образовании сигнала детектора.
Дрейф нулевой линии - постепенное смещение регистрируемое на хроматограмме.
Хроматографический пик - участок хроматограммы, соответствующий площади
ограниченной функцией хроматограммы в момент выхода определяемого вещества из
колонки и базовой линией.
Основание пика - продолжение нулевой линии, соединяющее начало и конец
хроматографического пика.

40. Параметры

Площадь пика, S - площадь хроматограммы, заключенная между пиком и его
основанием. В первом приближении S = hWh
Ширина пика у основания, Wb - отрезок основания пика, отсекаемый двумя
касательными, проведенными в точках перегибов восходящей и нисходящей ветвей
хроматографического пика.
Ширина пика на полувысоте, Wh- отсекаемый пиком отрезок линии, проведенной
параллельно основанию пика на середине его высоты.

41. Объем

Объем удерживания вещества, VR - объем подвижной фазы, затрачиваемой
на элюирование пробы вещества. Объем удерживания определяют между
точкой ввода пробы и точкой, при которой регистрируется максимум сигнала
детектора.
Мертвый объем, VM - объем подвижной фазы между точкой ввода пробы и
точкой ее обнаружения (кюветой детектора). Мертвый объем включает в себя
свободный объем колонки, объемы устройства ввода пробы (дозатора),
детектора, а также объемы коммуникаций между ними.
Приведенный объем удерживания, VR’ - объем удерживания вещества за
вычетом мертвого объема:
VR' = VR - VM

42. Время

Абсолютное время удерживания вещества, tR - время пребывания
исследуемого вещества в хроматографе. Практически время удерживания
определяют от момента ввода пробы вещества в хроматограф до момента
регистрации максимума соответствующего хроматографического пика.
Мертвое время, tM - время пребывания несорбируемого вещества в
хроматографе. На практике мертвое время определяют от момента ввода
пробы несорбируемого вещества в хроматограф до момента регистрации
максимума сигнала детектора.
Приведенное время удерживания, tR’ - абсолютное время удерживания за
вычетом мертвого времени:
tR'= tR- tM.

43. Эффективность

Эффективность хроматографической системы - количество ступеней установления
равновесия между подвижной и неподвижной фазой в выбранных условиях для
данного сорбата, способность к образованию узкой концентрационной зоны
индивидуального компонента разделяемой смеси. Эффективность в численном
выражении определяется значениями числа теоретических тарелок и высотой,
эквивалентной теоретической тарелке.
Число теоретических тарелок, N - величина, характеризующая качество колонки и
рассчитываемая по параметрам удерживания выбранного вещества по формуле
N = 16(tR/Wb)2 = 5.545(tR/Wh)2,
где tR - время удерживания пика, Wb - ширина пика на его полувысоте, Wh - ширина
пика у основания.
Высота, эквивалентная теоретической тарелке, H - величина, характеризующая
качество колонки и рассчитываемая как отношение длины колонки L к числу
теоретических тарелок
H = L/N

44. Параметры эффективности

Приведенное число теоретических тарелок N’ - отношение числа реально полученных
теоретических тарелок на колонке данной длины к условной колонке длиной 1 м.
N=100N/L,
где L - длина колонки в см.
Приведенная высота, эквивалентная теоретической тарелке
H’=H/d,
где d - средний (эффективный) диаметр частиц сорбента (мкм), она также является
характеристикой эффективности колонки. Вполне удовлетворительным принято считать колонки со
значением H равным 3-3,5d. Очень хорошими считаются колонки с Н равным 2d.
Фактор удерживания (коэффициент емкости), k' - один из основополагающих параметров
удерживания в жидкостной хроматографии, безразмерная величина, характеризующая
удерживание вещества и равная отношению приведенного времени удерживания к мертвому
времени
k’=t’R/t’M.

45. Смысл

Эффективность колонки - характеристика качества
колонки, определяемая числом теоретических тарелок и
высотой
теоретической
тарелки.
Эффективность
колонки тем выше, чем уже ширина пика при том же
времени
удерживания.
Эффективность
колонки
измеряется числом теоретических тарелок N. Чем выше
эффективность, тем больше величина N, тем меньше
расширение первоначально узкой концентрационной
зоны по мере прохождения ее через колонку, а значит,
уже пик на выходе из колонки.

46. Селективность

Селективность (относительное удерживание, αR/cm, фактор разделения, α)
хроматографической
системы
избирательность,
способность
к
специфическим взаимодействиям подвижной и неподвижной фазы с
молекулами
сорбата,
обладающими
определенными
структурными
признаками, приводящая к разной скорости перемещения концентрационных
зон
индивидуальных
компонентов.
Количественно
селективность
выражается как:
безразмерная величина, равная отношению приведенного объема (времени)
удерживания определенного вещества, взятого для сравнения (стандарта) и
хроматографируемого в идентичных условиях
αR/cm = kR/kcm = tR'/tcm' = VR'/Vcm’

47. Селективность

Селективность колонки зависит от многих факторов,
варьируя которые можно подобрать оптимальные
условия
хроматографии
интересующей
экспериментатора смеси компонентов. Исходя из
химической
природы
разделяемых
компонентов,
хроматографист должен выбрать подходящий состав
растворителя (подвижную фазу) и соответствующий по
химической природе сорбент. Определенное влияние на
селективность имеют и такие термодинамические
факторы, как температура и давление в колонке,
изменяющие коэффициенты распределения веществ
между подвижной и неподвижной фазами.

48. Параметры пиков

Коэффициент асимметрии АS - отношение двух отрезков, образуемых на
горизонтальной линии, проведенной на высоте 10 % от основания пика, при ее
пересечении с вертикалью, опущенной из вершины пика. При этом берется отношение
"тыльного" отрезка к "фронтальному"
АS = B/A
Разрешение пиков, RS - расстояние между максимумами выбранных соседних пиков,
деленное на полусумму их ширин у основания (выраженных в одних и тех же единицах
измерения)
RS = 2(tR2- tR1) / (Wb1+Wb2)
Разрешение как параметр, характеризующий разделение пиков, увеличивается по мере
возрастания селективности, отражаемой ростом числителя, и роста эффективности,
отражаемой снижением значения знаменателя из-за уменьшения ширины пиков.
Экстраколоночное расширение пика (ЭКР) - размывание хроматографической зоны,
происходящее в инжекторе, соединительных капиллярах, в ячейке детектора.

49. Эффективность и селективность

50. Заключение

• ВЭЖХ – мощный метод анализа сложных смесей
• Наиболее часто используется обращенно-фазовая
ВЭЖХ
• Хроматограф включает следующие узлы
Дегазатор подвижной фазы
Градиентный смеситель
Насос
Инжектор
Колонка
Детектор
Коллектор фракций