Определение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови кинетическим методом

1.

Индивидуальное задание по практике
По дисциплине: Биохимия с биохимическими исследованиями
По теме: Определение активности аланинаминотрансферазы в
сыворотке крови кинетическим методом
Подготовила учащаяся : МДд-22
Сопот Карина Юрьевна
Специальность: Медико-диагностическое дело
Приняла: Дунайская Н.Е.
Мозырь,2017

2.

Аминотрансферазы (трансаминазы) — ферменты,
катализирующие межмолекулярный перенос аминогруппы от
соответствующих аминокислот на a-кетокислоты
(2-оксокислоты) с образованием новых кето- и аминокислот без
образования свободного аммиака, в качестве кофермента
используется витамин В6 (пиридоксин). Эти ферменты играют
центральную роль в обмене белков, осуществляя
окислительное дезаминирование аминокислот опосредованно
через глутаминовую кислоту. Образующаяся глутаминовая
кислота дезаминируется глутаматдегидрогеназой с
освобождением свободного аммиака и 2-оксоглутаровой
кислоты.

3.

В организме человека наибольшее значение имеют две
аминотрансферазы: аспартатаминотрансфераза (АСТ или
АсАТ) (L-аспартат:2-оксоглутарат-аминотрансфераза, КФ
2.6.1.1.) и аланинаминотрансфераза (АЛТ или АлАТ),
(L-аланин:2-оксоглутарат-аминотрансфераза, КФ 2.6.1.2.).
В клинической практике чаще всего определяют именно
активность этих двух ферментов. Существует также
другое название указанных ферментов: для АСТ —
глутаматоксалоацетатаминотрансфераза (ГОАТ), для АЛТ
— глутаматпируватаминотрансфераза (ГПАТ). Ниже
приведены реакции, катализируемые этими ферментами:
2-Оксоглутарат + Аспартат ↔ Глутамат + Оксалоацетат
2-Оксоглутарат + Аланин ↔ Глутамат + Пируват

4.

В основе спектрофотометрических методов лежит
использование оптического теста Варбурга (см выше). Эти
методы являются наиболее специфичными и точными для
исследования активности трансаминаз сыворотки крови,
основаны на различии поглощения окисленной и
восстановленной форм НАД при 340 нм и требуют постановки
индикаторных реакций, в которые вовлекаются продукты
основной реакции:

5.

Существующие методы определения активности
трансаминаз в сыворотке крови можно разделить на две
основные группы: колориметрические и
спектрофотометрические:

6.

В основе спектрофотометрических методов лежит
использование оптического теста Варбурга. Эти методы
являются наиболее специфичными и точными для
исследования активности трансаминаз сыворотки крови,
основаны на различии поглощения окисленной и
восстановленной форм НАД при 340 нм и требуют
постановки индикаторных реакций, в которые
вовлекаются продукты основной реакции:
Оксалоацетат + НАДH ↔ Малат + НАД
Пируват + НАДH ↔ Лактат + НАД

7.

Группа колориметрических методов:
основанные на образовании окрашенного
динитрофенилгидразона пировиноградной кислоты.
Наибольшее применение нашел метод
Райтмана-Френкеля, являющийся технически простым
и дающим воспроизводимые результаты.
азометоды, основанные на образовании цветного
соединения между щавелевоуксусной кислотой и
6-бензамидо-4-метокситолуидиндиазониевым
хлоридом. Эти методы используются для определения
активности АСТ, просты в исполнении, но требуют
редких реактивов.

8. Влияющие факторы

Аспирин, барбитураты, пенициллин, опиаты, прием
пиридоксальфосфата, внутримышечные инъекции
завышают результаты исследования. Необходимо избегать
гемолиза, так как в эритроцитах активность фермента в 6
раз выше, чем в сыворотке.

9. Клинико‑диагностическое значение

Определение активности АСТ и АЛТ является чувствительным
тестом для диагностики инфаркта миокарда, который не
выявляется на ЭКГ, активность АСТ возрастает через 4-6 часов
от начала ангинального приступа, спустя 24-36 часов достигает
максимума и нормализуется на 3-7 день. Вторичное повышение
свидетельствует о повторном инфаркте. Величина активации
фермента зависит от обширности поражения миокарда: в
тяжелых случаях установлено 20-кратное повышение
активности АСТ и 10-кратная активация АЛТ.

10.

Особенно важное значение имеет определение
активности аминотрансфераз для диагностики
заболеваний печени. Некроз или повреждение
печеночных клеток любой этиологии (острый и
обострения хронического гепатита, холестатическая
и обтурационная желтуха, лекарственноиндуцированное поражение) сопровождаются
повышением активности обоих ферментов,
преимущественно АЛТ, коэффициент де Ритиса =
АСТ/АЛТ < 1,33. Уже в продромальном периоде
болезни Боткина и у больных с безжелтушной
формой гепатита активность АЛТ достоверно
возрастает. Выявлены случаи, когда активность АЛТ
составила 64 ммоль/ч·л, а АСТ — 27 ммоль/ч·л.

11.

Менее высокое увеличение активности отмечено при
циррозе печени, травме скелетных мышц, миозите,
миопатиях, тепловом ударе, миокардите, некоторых
опухолях печени, гемолитических болезнях.

12. Ход определения

Перед определением температура растворов и сыворотки должна
быть доведена до температуры измерения. Перед работой можно
готовить смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного
раствора, раствора НАДН, МДГ и ЛДГ в соотношении 60 : 1 : 1 : 1.
Определение проводят по следующей схеме.
Перемешивают и через 60 сек. (лаг-фаза) измеряют экстинкцию и
одновременно включают секундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или
через более короткие, но равные промежутки времени) измеряют
экстинкцию.
Поправку на холостой опыт проводят по формуле:
(ΔΕ/Δt)оп – (ΔΕ/Δt)хол = (ΔΕ/Δt)скор.
Скорректированную величину опытной пробы используют в
дальнейших расчетах.

13. Расчет производят по формуле:

Активность, моль/(с∙м3) = нмоль/(с∙л) ґ 106 = Vр.с / ε ґ 1∙Vсыв
ґ (ΔΕ / Δt)скор,
где Vр.с — объем реакционной смеси, мл;
Vсыв — объем сыворотки, мл;
t — время реакции, сек.;
ΔΕ / Δt — изменение экстинкции за 1 сек.;
ε — κоэффициент молярной экстинкции НАДН в м2 ґ моль–
1;
1 — толщина слоя жидкости в кювете в метрах (1∙102).

14.

Определение активности фермента можно проводить по
микрометоду. Для этого перед работой готовят смесь реактивов,
состоящую из субстратно-буферного раствора, растворов
НАДН, ЛДГ, МДГ в соотношении 60 : 1 : 1 : 1. Опытная проба
включает смесь реактивов — 0,630 мл, сыворотку — 0,10 мл, αкетоглутаровую кислоту — 0,02 мл. Холостую пробу ставят так
же, как опытную, но вместо сыворотки добавляют 154 ммоль/л
раствор хлорида натрия. Определение проводят по той же
схеме, что и в макрометоде.

15.

Спасибо за внимание!