Протоночная цитометрия

1. Проточная цитометрия

.

2. Проточная цитометрия.

Клетки крови можно дифференцировать на основе
лазерной цитофлюорометрии. Искомые клетки,
точнее их маркеры – CD-антигены, окрашивают
флюоресцирующими антителами. Для окрашивания
клеток (например, CD4+, CD8+-Т-лимфоцитов)
применяют моноклональные антитела против их
CD-антигенов, меченные
флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТС), дающим
зеленую флюоресценцию, или фикоэритрином,
дающим красное свечение.

3. .

4. Образец крови после обработки меченными моноклональными антителами пропускают через тонкую трубку. Через исследуемый образец

пропускают лазерный луч, который
возбуждает свечение флюорохрома.

5. Фотоумножитель улавливает светорассеивание, по которому анализируется размер, гранулярность клетки, и регистрирует

флюоресценцию,
свидетельствующую о количестве меченых антител,
связанных с клеткой. Интенсивность флюоресценции
коррелирует с плотностью антигенов на поверхности
клеток и может быть количественно измерена с
помощью фотоэлемента. Полученные результаты
преобразуются в гистограмму.

6. Рис.32. Проточная цитометрия (гистограмма)

7. Проточная цитометрия.

Образцы
кровь
костный мозг
ликвор
суставная жидкость
плевральная жидкость
асцитическая жидкость
суспензированные клетки тканей (например, опухолей)
суспензия микрочастиц (флуоресцентные микросферы и
т.п.)

8. Проточная цитометрия.

Преимущества
короткое время анализа за счет высокой скорости
(до 100 000 событий в секунду)
анализ большого количества клеток (до 108 клеток в
мл)
определение субпопуляций клеток
измерение параметров редко встречающихся клеток
объективное измерение интенсивности
флуоресценции

9. Проточная цитометрия.

Применение
Иммунология
иммунофенотипирование клеток периферической крови
определение фагоцитарной активности (захват меченных
флюорохромами бактерий или дрожжей)
определение внутриклеточных цитокинов (спонтанная
продукция и под действием различных специфических или
неспецифических активаторов, таких как ФМА + иономицин,
ЛПС, ФНО-альфа)
определение внутриклеточных белков, например
транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для
дискриминации CD4 Т-лимфоцитов
определение пролиферативной активности (выявление
инкорпорированого бромдезоксиуридина)
исследование клеточного цикла
оценка клеточной цитотоксичности