Проточная цитометрия в клинической лабораторной практике

1.

BCISA
ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ
В КЛИНИЧЕСКОЙ
ЛАБОРАТОРНОЙ ПРАКТИКЕ
КАЗАКОВ Сергей Петрович
Профессор кафедры иммунологии РМАПО
(версия 06.2015 г.)

2.

Историческая справка
BCISA
Определение субпопуляций
2-мя методами:
1. Исследование субпопуляций с
использованием эритроцитов мышей
и барана Еrok и Trok (1965-1995)
ОПРЕДЕЛЕНИЕ:
- Т-лимфоцитов
- В-лимфоцитов
- Та-лимфоцитов

3.

Историческая справка
2. Исследование субпопуляций с
использованием моноклональных
антител и флюоресцентной детекции
(1985-2002)
Определение:
Т-лимфоциты
В-лимфоциты
Т-хелперы
Т-цитотоксические
и другие субпопуляции, меченные
одним моноклональным антителом
Качество ????
BCISA

4.

Внешний вид Проточного
Цитометра BD FACS Calibur
.
BCISA

5.

Распределение лазерного пучка
по спектрам
BCISA

6.

Оптические фильтры
BP525
BP575
BP620
BP675
BCISA

7.

Используемые флуорохромы
BCISA
Dye
Excitation
Emission
Molecular
Weight
FITC
488 nm
520 nm
389 Da
PE
488 nm
578 nm
240 000 Da
ECD
488 nm
613 nm
250 000 Da
PC5
488 nm
668 nm
250 000 da
PerCP
488 nm
688 nm
35 000 Da
APC
613 nm
665 nm
105 000 Da

8.

Сравнительная характеристика
различных флуорохромов
CD8-FITC
CD8-PE
CD8-ECD
CD8-PC5
CD8-PerCP
CD8-APC
PerCP < APC < FITC < ECD < PC5 < PE
BCISA

9.

Этапы анализа
1
2
Ручная подготовка
Аппаратная подготовка
Исследований - 30 минут 20 минут
BCISA
3
Анализ – 1 проба - 2 минуты

10.

Техника окраски
BCISA
Многоцветный анализ
Y
Y
mab2 PE
mab1 FITC
Детекция минимум 4-х
маркеров на одной
клетке

11.

Субтипы лимфоцитов
BCISA
T ЛИМФОЦИТЫ
B ЛИМФОЦИТЫ
CD 3
CD19
CD 4
CD 3
CD 8
CD20
Клетки хелперы
Секреция антител
Цитотоксические
клетки
Помогают В-лимфоцитам
Ответственны за
отвечать на сигнал
уничтожение
Помогают цитотоксическим
лимфоцитам уничтожать инфицированных и
опухолевых клеток
инфицированные
клетки
ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ
КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ

12.

Анализ
BCISA

13.

Проблемы выделения
Нормальная
сыворотка
Ненормальный
лизис
BCISA
Старая
сыворотка

14.

Классификация иммунной
системы
BCISA
1. Неспецифическая иммунная система
- Клеточное звено
(моноциты, макрофаги, дендритные клетки, NK-клетки)
- Гуморальное звено
(комплимент, лизоцим, др. белки)
2. Специфическая иммунная система
- Клеточное звено
( Т-хелперы, Т-цитотоксические, ТNK-клетки, В-лимфоциты)
- Гуморальное звено
(Иммуноглобулины А,М,G,D,Е)

15.

Принципиальная схема передачи
сигнала в иммунной системе.
BCISA
Противобактериальный
Противовирусный,
иммунитет
Антигенпрезентирующие
клетки
(моноциты,
макрофаги,
дендритные
клетки,
NK-клетки)
Т-хелперы
Тхо
Т-хелперы
Первого
Порядка
Тх1
Т-цитотоксические
лимфоциты
Противоопухолевый
противовирусный
иммунитет
ТNK - клетки
Противобактериальный
Противоопухолевый
иммунитет
Т-хелперы
второго
Порядка
Тх2
Гуморальный
Иммунитет
И
Ауто-иммунитет
В-лимфоциты И
Аллергия

16.

Субпопуляции лимфоцитов
BCISA
CD3+CD45RA+
памяти - СD3+CD45RO+
СD3+CD4+CD45RO+
CD3+CD8+CD45RO+
активированные - CD3+/HLA-DR+/CD25+
Т-хелперы
CD3+CD4+
хелперы-индукторы-CD4+CD45RA+(40 %)
Цитотоксические
T-клетки - CD3+CD8+
активированные
цитотоксические - CD3+CD8+HLA-DR+
T-Клетки

17.

Субтипы лимфоцитов II
BCISA
В-клетки CD19+IgM+ and IgD+
наивные
CD19+/CD45RA+
памяти
CD19+/CD27+/СD5активированные СD19+/CD23+
плазматические CD38+/CD138+
NK клеткиCD16+CD56+
LGL-NK клетки CD2+,CD16+,CD56+,CD57+/TNK клетки
CD2+,CD3+, TcR+, CD16+,
CD56+, CD57+/-

18.

Стандартная панель для
иммунного статуса
FITC
IgG
CD45
CD3
CD3
CD3
CD3
PE (=RD1)
IgG
CD14
CD19
CD4
CD8
CD56 (+/-CD16)
Реактивы
Контроль
Гейтинг (Моноциты)
T/B-клетки
T-хелперы
T-цитотоксические
NK-клетки
Наборы ВD – Multitest –4-х
параметрические:
- СD3/СD4/СD8/CD45
- CD3/CD(16+56)/CD19/CD45
BCISA

19.

Оценка ВИЧ-инфекции
BCISA
Стадии заболевания, основанные
на СD4+ клетках
Стадия
1
2
3
CD4+ клетки
ml крови
> 500
200 - 499
< 200
% CD4+ клетки
> 29
14 - 28
< 14

20.

Стволовые клетки
BCISA
Стволовая клетка
Полипотентная
дифференциация

21.

CD34-популяции
BCISA
CD33
CD38
CD61
CD90
CD116
CD117
CD135
CD155
CD164
HLA-DR ...

22.

Методика изучения
сывороточных цитокинов
BCISA

23.

Исследование плазменных
цитокинов, хемокинов, молекул
адгезии, факторов роста
BCISA

24.

Исследование внутриклеточных
цитокинов
BCISA

25.

Клеточный цикл и участвующие
в нем белки
BCISA

26.

Клеточные антигены
пролиферации
BCISA
cyclinB/cdc2
Ki-67
PCNA
Cyclins
G2
M
cyclinA/cdk2
G1
cyclinD/cdk4
S
cyclinE/cdk2
p53

27.

Окраска клеточного цикла
G1
S
M
G2
BCISA

28.

Апоптоз
BCISA
1.
Нормальная клетка
2.
Клеточная и хроматиновая
конденсация
3.
Формирование апоптотических
антител
4.
Фагоцитоз окружающими
фагоцитами/моноцитами
5.
Разрушение ДНК
6.
Некроз - Сморщивание и
разрушение клеточной мембраны
From Kerr J.F.R., et. al. (1994) Cancer 73:2013-2026

29.

Сигналы апоптоза
BCISA

30.

Исследования
тромбоцитов
BCISA
Тромбоциты играют
интегральную роль в
гемостазе.
Моноклональные
антитела способны
проводить
исследования в
следующих
направлениях:
• Функция тромбоцитов
• Активация тромбоцитов
• Ретикулярные тромбоциты
• Исследование адгезии

31.

Тромбоциты и их рецепторы
GPIIb-IIIa
CD41/CD61
GPIb-IX
CD42b/CD42a
GPIa-IIa
CD49b/CD29
GPIc-IIa
CD49e/CD29
GPIc´-IIa
CD49f/CD29
GPIIa´
CD31
GPIV
CD36
GMP-140
CD62P
GP53
CD63
Vitronectinreceptor a CD51
Vitronekcinreceptor b
CD61
Thrombinreceptor
Thrombospondin
BCISA
Thrombinreceptor
CD62p

32.

Покоящиеся тромбоциты
BCISA

33.

Литература по проточной
цитометрии
BCISA

34.

Литература по проточной
цитометрии
BCISA

35.

Литература по проточной
цитометрии
BCISA

36.

BCISA
Благодарю Вас за внимание!!!