Строение и свойства ДНК

1. Строение и свойства ДНК

Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное бюджетное государственное образовательное учреждение
высшего образования «Оренбургский государственный университет»
Химико-биологический факультет
Кафедра биохимии и микробиологии
Строение и свойства ДНК
Лабораторная работа №2
по «Генетике микроорганизмов»
Давыдова Ольга Константиновна, к.б.н., доцент

2. План:

Стабилизация двойной спирали ДНК
Основные физико-химические свойства ДНК
Измерение спектров поглощения ДНК
Гипохромизм ДНК
Денатурация ДНК. Кривые плавления
Определение гиперхромного эффекта ДНК
Ренатурация
Связывание лигандов с ДНК

3.

Стабилизация
двойной спирали ДНК

4.

1) Водородные
связи
A•T - 2 водородные связи
G•C - 3 водородные связи

5.

2) Стэкинг-взаимодействия
Стэкинг ароматических колец азотистых оснований стабилизруется
гидрофобными взаимодействиями и дипольными взаимодействиями.
Различные последовательности имеют различные стэкингвзаимодействия,.
Термодинамические
параметры могут быть
расcчитаны для
различных
динуклеотидных
шагов.

6.

3) Ионные взаимодействия
Основания гидрофобны; PО-2 – гидрофильны, но электростатическое
отталкивание дестабилизирует двойную спираль. Для стабилизации
необходимы противоионы – одновалентные катионы металлов.
4) Гидратация
Упорядоченная гидратная (связанная) вода
(хребет гидратации в малом желобке).

7.

Физико-химические
свойства ДНК
Кислотно-основные свойства
ДНК – многоосновная кислота, Фосфатные группы определяют заряд. Устойчивость
двуцепочечной ДНК является фунцией рН в диапазоне от 4 до 11 единиц.
Плотность
нуклеиновых кислот близкая к 1,7, являющаяся следствием значительного содержания
фосфора.
Вязкость
Упругие нитевидные молекулы большой длины определяют очень высокую вязкость и её
зависимость от молекулярного веса.
Следует учитывать ломкость её молекул даже при небольших градиентах скорости
среды.
Оптические свойства
нуклеотиды имеют максимум поглощения света вблизи 260 нм. Вхождение нуклеотидов
в состав нуклеиновых кислот практически не изменяет положение максимума, но
значительно снижает интенсивность поглощения - гипохромный эффект, обусловлен
строго упорядоченным, параллельным расположением плоскостей гетероциклических
колец оснований

8.

Поглощение в
УФ диапазоне

9.

Поглощение в
УФ диапазоне
path length, usually 1 cm
A=εcl
absorbance
concentration
сoefficient extinction

10.

Гипохромизм
Absorbance
Absorbance maximum
for single-stranded DNA
Absorbance
maximum for
double-stranded DNA
220
260
300
The absorbance at 260 nm of a DNA solution increases
when the double helix is melted into single strands.

11.

Денатурация ДНК
Переход ДНК из упорядоченной
структуры в неупорядоченную протекает с
образованием промежуточных состояний –
петлеобразных частично расплетенных
структур

12.

Денатурация ДНК
Денатурация ДНК заключается
в разрыве Н-связей и стэкингвзаимодействий, что приводит к
расплетанию и разделению
цепей. (БЕЗ РАЗРЫВА
КОВАЛЕНТНЫХ СВЯЗЕЙ!) под
действием температуры или рН.
Гипохромизм двуцепочечных
нуклеиновых кислот
обусловливает при денатурации
обратный гиперхромный
эффект.

13.

Гиперхромизм
Hyperchromic effect:
• stacking of nucleotide bases decreases ε.
• bases in ss absorb more than bases in ds.
• absorbance increases as DNA denatures.

14.

Кривая плавления
Tпл – температура
середины
перехода
Тпл
Тпл –
температурный
интервал
перехода
Если бы препараты ДНК представляли собой смесь абсолютно одинаковых
молекул, то кривая плавления образовала бы очень резкий переход – почти
ступеньку – при температуре плавления. В действительности регистрируются
довольно отлогие S-образные кривые, почти симметричные в точке перегиба.

15.

Кривая плавления
оптическая плотность, отн. ед.
1,4
1,35
1,3
1,25
1,2
ΔH
1,15
1,1
1,05
Tн
1
20
30
40
T оп
50
60
70
80
90
ΔT
температура, оС
Абсцисса точки перегиба, соответствующая половине гиперхромного
эффекта, принимается как температура плавления Тпл.
Наиболее тугоплавкими являются ДНК, богатые ГЦ-парами, а легче всего
плавятся ДНК АТ-типа.

16.

Денатурация ДНК
Average base
composition
(G-C content) can be
determined from the
melting temperature of
DNA

17.

Ренатурация ДНК

18.

Молекулярная гибридизация
Если свести вместе продукты
денатурации целых молекул ДНК,
лишь частично совпадающих по
нуклеотидным последовательностям,
то в условиях ренатурации будут
возникать двуцепочечные молекулы
не только из гомологичных цепей, но
и из цепей разных ДНК. Этот
процесс называют молекулярной
гибридизацией.
Чем ближе по первичной структуре
сводимые ДНК, тем будет больше
протяжённость спирализованных
участков в гибридной молекуле. По
доле последних можно
количественно оценивать сходство
нуклеотидных последовательностей
ДНК разных организмов и таким
образом судить о степени их
генетической близости.

19.

Связывание лигандов
с ДНК
R1
H
N
8
O
O
N
9
7
H
N
6
11
5
12
NH2
1
10
2
4
3
O
CH3
R2
O
CH3

20.

Связывание лигандов
с ДНК
DNA
DNA - 6-AZC
1,0
0,8
0,6
Tm
0,4
0,2
0,0
40
45
50
55
60
65
70
T,oC

21.

Связывание лигандов
с ДНК
в малом желобке
(нетропсин)
по типу интеркаляции
(актиномицин D)