Микробиологический метод исследования. Техники посева и режимы культивирования

1. Занятие 4 «Микробиологический метод исследования. Техники посева и режимы культивирования. Особенности выбора режимов

ФГБОУ ВО Самарский государственный медицинский
университет Минздрава России
Кафедра медицинской микробиологии и
иммунологии
Дисциплина: «Основы микробиологии»
Занятие 4
«Микробиологический метод
исследования. Техники посева и
режимы культивирования.
Особенности выбора режимов
культивирования для
микроорганизмов, имеющих
метаболические особенности»

2. Микробиологический метод исследования

Метод, основанный на
культивировании
микроорганизмов на
питательных средах, с
последующим изучением
свойств выделенных культур
и определением вида
микроорганизма.

3. Микробиологический метод включает ряд этапов:

• Преаналитический (выбор вида биоматериала, его корректный
сбор и транспортировка в лабораторию).
• Аналитический (выбор питательных сред для первичного посева с
учетом особенностей биоматериала и заболевания пациента, посев
и культивирование с учетом физиологических особенностей
предполагаемых возбудителей, выделение чистой культуры
микроорганизмов, их идентификация, определение
чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам).
• Постаналитический (формирование микробиологического
заключения и его интерпретация лечащим врачом).

4. Знаете ли Вы, что…

более 80% ошибок при
проведении лабораторного
исследования приходится на
преаналитический и
постаналитический этапы, т.е. по
факту за пределами лаборатории.

5.

Для получения культур
микроорганизмов, изучения их
биологических свойств, а также
сохранения выращенных культур в
условиях лаборатории
используются питательные среды.

6. По назначению питательные среды делятся на:

Среды общего
назначения
Среды
специального
назначения

7. Среды общего назначения

Среды общего
назначения
(универсальные), такие
как мясопептонный
агар или бульон,
кровяной агар, на них
может расти
большинство
микроорганизмов.

8. Среды специального назначения

Среды обогащения – питательные
среды, в которых создаются особые
оптимальные условия для
культивирования определенных
бактерий (например, шоколадный
агар для культивирования
гемофильной палочки).
Данные среды не блокируют рост
остальных микробов, но создают
комфортные условия для роста
искомого микроба.

9. Среды специального назначения

Селективные (элективные)
среды в которых содержатся
добавки ингибиторов
(антибиотики или соли
желчных кислот),
блокирующих рост
нежелательной микрофлоры,
и позволяющие вырасти
искомому микробу (например,
висмут-сульфитный агар для
сальмонелл).

10. Дифференциально-диагностические среды

Дифференциальнодиагностические среды
Дифференциально-диагностические среды
используются для дифференцировки
микроорганизмов на основании их биохимической
активности.
1. Основанные на дифференциации по 1-2 сахарам
2. Основанные на дифференциации по ряду сахаров
3. Хромогенные среды

11. Дифференциально-диагностические среды

Дифференциальнодиагностические среды
Среди них можно выделить среды,
дифференцирующие бактерии по их
способности к утилизации одного
или нескольких сахаров.
Среда Эндо или МакКонки
позволяет отделить
расщепляющие и не
расщепляющие лактозу виды по
цвету колоний, за счет добавления
в среду лактозы и цветового
индикатора утилизации лактозы.

12. Дифференциально-диагностические среды

Дифференциальнодиагностические среды
Наборы сред для видовой идентификации бактерий на
основании их биохимической активности (например, среды
Гисса, СИБ-слайды, API-слайды).
Представляют собой последовательность пробирок или
лунок на плашке, в каждую из которых добавлен углевод
и цветовой индикатор. По изменению цвета лунки
(пробирки) судят о расщеплении того или иного субстрата.
На основании совокупности признаков определяют вид
микроорганизма.

13. Дифференциально-диагностические среды

Дифференциальнодиагностические среды
Хромогенные питательные среды – это среды для быстрой
идентификации микроорганизмов. Принцип их действия
основан на взаимодействии высокоспецифичных ферментов
микрооорганизмов с хромогенным субстратом, введенным в
среду и играющем роль индикатора.
Хромогенные вещества придают четко различимый цвет
каждому отдельному виду колоний. Это позволяет сократить
сроки проведения исследования и повысить его качество
(например, среда Уриселект для дифференцировки
уропатогенов или Кандиселект для грибов рода Candida).

14. Пример роста на хромогенных средах

15. Транспортные среды

Среды, предназначенные для сбора и транспортировки
биоматериала до лаборатории (среда Эймса, Стюатра).

16. Консервирующие среды

Среды для хранения
культур в лабораторных
условиях (триптикозосоевый бульон).

17. По составу питательные среды бывают:

Натурального
происхождения
(мясопептонный
агар,
картофельные
среды).
Полусинтетические
(среда Эндо, среда
Сабуро)
Синтетические
(большинство
современных
питательных
сред).

18. По консистенции среды бывают:

Жидкие
(бульоны)
Полужидкие
(содержат
0,5% агара)
Плотные
(содержат
1,5-2% агара).

19. По способу производства выделяют среды:

Коммерческого
производства:
• готовые (разлитые в
чашки и упакованные).
• сухие (в виде порошка и
инструкции для
приготовления).
Среды лабораторного
приготовления
(готовятся в
лаборатории по
прописям).

20. Автоматический розлив питательных сред

21. Основные компоненты питательных сред

В состав большинства сред входит азот, углерод, водород,
кислород, углеводы, неорганические соединения (фосфор,
калий, магний, железо и др.), формообразователи (агар).
При необходимости в состав среды могут быть включены
ростовые факторы (витамины, аминокислоты), кровь, сыворотка,
красители, индикаторы, ингибиторы роста сопутствующей
микрофлоры, а также дополнительные компоненты для
выявления факторов патогенности и ферментов агрессии
микрорганизма (желток для определения лецитиназы и липазы,
желатин для определения продукции протеолитических
ферментов).

22. Требования, предъявляемые к питательным средам:

• наличие всех необходимых источников питания в усваиваемой форме
и соотношениях, соответствующих соотношению в клетках;
• определенный рН, необходимый для роста искомого микроорганизма;
• определенный окислительно-восстановительный потенциал;
• изотоничность (осмотическое давление как в клетке);
• влажность;
• отсутствие ингибиторов роста;
• стерильность;
• соответствие требованиям по цветности, прозрачности, консистенции.

23. Клинический материал: от первичного посева к чистой культуре

При посеве клинического
материала в пробах, как правило,
присутствует смесь из
микроорганизмов.
Для того, чтобы определить вид
каждого микроорганизма,
необходимо произвести посев на
плотные питательные среды,
получить рост колоний
микроорганизмов и выделить
чистые культуры микробов.

24. Колония микроорганизмов

Популяция микробных клеток
одного вида,
сформировавшаяся в
результате деления одной
микробной клетки в условиях
культивирования на плотной
питательной среде,
структурная единица
микробной популяции на
плотной питательной среде.

25. Чистая культура. Штамм

Чистая культура – это совокупность микроорганизмов одного вида,
полученная как потомство одной клетки или одной колонии (путем
пересева изолированной колонии или исходного роста в первичном
посеве однородной культуры) (например, чистая культура золотистого
стафилококка).
Существует более узкое понятие – штамм.
Штамм – это чистая культура микроорганизмов одного вида,
полученная из определенного источника. Штаммы одного вида могут
отличаться по своим биологическим свойствам (продукции факторов
патогенности, чувствительности к антибиотикам и бактериофагам).

26. Знаете ли вы, что..

около 30% населения являются
носителями золотистого стафилококка
в полости носа.
Т.е. каждый третий студент в вашей
группе.
От всех вас можно получить чистую
культуру, но вот штамм у каждого
будет свой.

27. Одной из наиболее удобных является техника секторного посева по Голду

28. Техника посева «газоном»

29. Культивирование

Для культивирования
микроорганизмов необходимо
создавать оптимальную
температуру для их роста.
Для этого в лабораториях
используются термостаты –
приборы, способные
поддерживать заданную
температуру.

30. Оптимум температуры для роста

Для большинства патогенов,
имеющих значение в патологии
человека оптимальная
температура для роста,
соответствует 370С.
Такие микроорганизмы
называются мезофилы.

31. Оптимум температуры для роста

Существуют микроорганизмы, способные
расти при низких температурах. Они
называются психрофилы.
При этом строгие (облигатные) психрофилы
размножаются при температуре не выше
200С, а факультативные могут размножаться в
диапазоне от 22 до 300С.
Для выживания в условиях низких
температур они имеют специальные
ферменты, активные в холодных условиях,
высокое содержание жирных кислот в
клеточной стенке, а также способность
синтезировать криопротекторы.

32. Оптимум температуры для роста

Существуют микроорганизмы, способные выживать в
условиях высоких температур, более 450С. Они
называются термофилы.
В зависимости от диапазона комфортных для видов
температур можно выделить четыре подгруппы:
• термотолерантные (до 55-600С, при оптимуме 35-400С);
• факультативные (до 50-650С, но способны расти при
комнатной температуре);
• облигатные (до 700С, не растут при температуре ниже
400С);
• экстремальные и гипертермофилы (растут при
температуре до 1100С, при оптимуме рост 80-1050С).

33. В зависимости от метаболических особенностей выделяют:

• галофилы (микроорганизмы, обитающие в средах с
высокой концентрацией солей);
• ацидофилы (микроорганизмы, развивающиеся в средах с
повышенной кислотностью);
• алкалифилы (микроорганизмы, способные развиваться в
щелочной среде).

34. В зависимости от типа дыхания:

• Большинство микроорганизмов по типу дыхания
являются аэробами или факультативными анаэробами и
не требуют создания особой газовой среды для роста.
• Некоторые микробы лучше растут при добавлении в
состав газовой смеси 5-7% СО2, они называются
микроаэрофилами.
• Отдельную сложность представляет собой
культивирование облигатных анаэробов (выживают
строго в отсутствии кислорода).

35. Культивирование анаэробов

В современных условиях для культивирования облигатных
анаэробов
используют
специальные
коммерческие
питательные
среды
с
последующим
помещением
засеянных чашек в анаэробные условия.
Для создания анаэробных условий используются
специальные таблетки или пакетики с порошковой
смесью, при помещении которых в емкость с посевами и
последующей их активацией (вскрытие пакета, вода)
начинается химическая реакция, связанная с удалением
кислорода из среды и продукцией инертного газа.

36. Культивирование с применением газогенерирующих пакетов

37. Культивирование в анаэробной станции

• Анаэробная станция — это изолированный от внешней
среды перчаточный бокс для создания стабильных
условий анаэробиоза.
• Она позволяет проводить все стадии исследований
(полный цикл от первичного посева до учета
антибиотикорезистентности), обеспечивая подходящие
условия для обработки, инкубирования и проверки
образцов, не подвергая их воздействию атмосферного
кислорода.

38. Анаэробная станция: полноцикловая работа с анаэробами

39. Ранее использовались, но теперь практически не применяются:

✓ Регенерация сред (удаление кислорода из среды при ее кипячении с последующим
быстрым охлаждением).
✓ Посев в высокий столбик агара (метод Вейнберга) - принцип основан на том, что в глубине
столбика агара создаются условия для роста анаэробов.
✓ Метод Фортнера – совместное культивирование аэробов и анаэробов.
✓ Культивирование с использованием среды Китта-Тароцци. Эта жидкая питательная среда
содержит кусочки печени и других паренхиматозных органов, обладающих способностью
адсорбировать на себя кислород из среды, тем самым оставляя жидкую фракцию (бульон) без
кислорода, в котором и происходил рост анаэробов. Для предотвращения попадания
кислорода извне в пробирку со средой сверху наливали слой вазелинового масла.
✓ Метод Вейона-Виньяля – основан на культивировании в герметичном запаянном
стеклянном капилляре (пипетке), а котором создавались бескислородные условия.
✓ Метод Перетца – основан на культивировании между двумя плотно притертыми стеклами,
между которыми также отсутствовал кислород.

40. Особенности культивирования микроорганизмов, имеющих метаболические особенности

Риккетсии, коксиеллы, анаплазмы, эрлихии и ориентии,
вирусы и хламидии являются микроорганизмами,
зависимыми от метаболизма эукариотических клеток.
Ввиду этого они не растут на питательных средах.

41. Для их культивирования используют:

• чувствительных лабораторных животных (мышей,
морских свинок, кроликов) с последующим их
изучением;
• куриные эмбрионы в сроке жизни 8-12 суток;
• культуры клеток.

42. Культивирование спирохет

Патогенные трепонемы не способны расти на
питательных средах, куриных эмбрионах или культурах
тканей. Лишь редкие сапрофитические виды способны
расти на печеночном бульоне с добавлением органных
кусочков.
Боррелии способны расти на средах с добавлением крови
и сыворотки, залитых слоем вазелинового масла. Также
они культивируются на куриных эмбрионах, в организме
белых мышей и морских свинок.
Лептоспиры выращиваются на стерильной
дистиллированной воде с добавлением 10% сыворотки,
пептона, поваренной соли, или полужидкой агаровой
среде, с гемолизированной кроличьей кровью.

43. Культивирование микоплазм и уреаплазм

Микоплазмы и
уреаплазмы можно
выращивать на плотных,
жидких и полужидких
коммерческих
питательных средах, а
также в культуре тканей.

44. Культивирование актиномицетов

Актиномицеты способны расти на бактериологических
питательных средах, однако требуют длительной
инкубации, создание оптимальной газовой атмосферы.

45.

Вопросы?