ИПСК Лешкевич, 3108 гр

1.

ИНДУЦИРОВАННЫЕ ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ: ОТ ПОЛУЧЕНИЯ ДО
ПРИМЕНЕНИЯ В БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Подготовил студент : Лешкевич Н.Ф.,
группа 3108 мед.-проф. фак.
Научный руководитель: доцент, к.б.н Мезен Н.И.

2.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ
01 Анализ литературных данных
Рассмотреть понятие о плюрипотентных
стволовых клетках
02
наиболее эффективные способы
03 Выделить
их получения
свойства индуцированных
04 Изучить
плюрипотентных стволовых клеток.
05
Найти аспекты использования в биохимич
еских и биомедицинских исследованиях.

3.

Тип
клеток
ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ
СТВОЛОВЫЕ
КЛЕТКИ
ВЗРОСЛЫЕ
СТВОЛОВЫЕ
ПОЛУЧЕНИЕ
Клетки
внутренней
клеточной массы
бластоциста
Клетки
из тканей
взрослого
человека
Соматические клетки
перепрограммированные
в эмбриональные
плюрипотентные
стволовые клетки
САМООБНОВЛЕНИЕ
ВЫСОКОЕ
ОГРАНИЧЕННОЕ
ВЫСОКОЕ
ПАТЕНТНОСТЬ
ПЛЮРИПАТЕНТНОСТЬ
Может дифференцироваться
в клетки каждого из
трех зародышевых листков
Мультипатентность
ПЛЮРИПАТЕНТНОСТЬ
Может дифференцироваться
в клетки каждого из
трех зародышевых листков
есть
нет
ЭТИЧЕСКИЕ
ПРОБЛЕМЫ
КЛЕТКИ
Может
дифференцировться
в клетке одного
зародышевого листка
Табл. 1-Происхождени стволовых клеток
ИНДУЦИРОВАННЫЕ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ
СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ
(ИПСК)
минимальные

4.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И СВОЙСТВА ИНДУЦИРОВАННЫХ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Впервые прямое репрограммирование
соматических клеток с помощью набора
транскрипционных факторов (ТФ) было
осуществлено в 2006 году японскими
исследователями Такахаши и Яманакой,
что послужило началом направления
исследований в области биологии развития.
Лаборатория Яманаки работала над поиском
факторов, поддерживающих в ЭС клетках
программу плюрипотентности.
Рис. 1- Индуцированная стволовая клетка

5.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Рис. 2-Эксперменент Яманаки

6.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

7.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И СВОЙСТВА ИНДУЦИРОВАННЫХ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ УЧАВСТВУЮЩИЕ В РЕПРОГРАММИРОВАНИИ
Транскрипционный фактор Oct.
Этот ТФ, также известный как Oct3/4(POU5F1), возможно,
является ключевым в регуляции плюрипотентности.
Гомеодомен-содержащий белок, кодируемый геном
Oct4(роu5f1), связывается с последовательностью
ДНК 5'–ATGCAAT–3', Таким образом, подтвержается его
основополагающая роль в индукции плюрипотентности
и в контроле дифференцировки клеток.

8.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И СВОЙСТВА ИНДУЦИРОВАННЫХ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ УЧАВСТВУЮЩИЕ В РЕПРОГРАММИРОВАНИИ
Транскрипционный фактор Sox2.
Sox2 относится к членам Sox семейства ТФ,
участвующих в регуляции разных этапов клеточного
развития и дифференцировки. Белки этого семейства
имеют высококонсервативный ДНК-связывающий
домен, известный как HMG и состоящий примерно из
80 аминокислотных остатков. Данная группа белков
участвует в регуляции транскрипции и архитектуры
хроматина. Sox2 образует комплекс с Oct4, который
участвует в регуляции экспрессии генов UTF1, Fgf4,
Fbx15, необходимых для поддержания
плюрипотентности ЭС клеток.

9.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И СВОЙСТВА ИНДУЦИРОВАННЫХ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ УЧАВСТВУЮЩИЕ В РЕПРОГРАММИРОВАНИИ
Транскрипционный фактор Klf4.
Klf4 относится к семейству транскрипционных факт
оров Kruppel-like. Белки этого семейства вовлечены
в самые разнообразные процессы такие как:
эмбриональное развитие, клеточная пролиферация,
дифференцировка и апоптоз. В экспериментах на
мышах была продемонстрирована
последовательная экспрессия этого гена во время
эмбрионального развития. Так, вначале экспрессия
Klf4 обнаруживается в экстраэмбриональных
тканях, затем в желудочно-кишечном тракте и,
наконец, в развивающихся слоях кожи эмбриона.

10.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И СВОЙСТВА ИНДУЦИРОВАННЫХ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ УЧАВСТВУЮЩИЕ В РЕПРОГРАММИРОВАНИИ
Транскрипционный фактор с-Мyc.
С-Мyc – мультидоменный ТФ, также
участвующий в процессах пролиферации,
дифференцировки и клеточного роста. Показано,
что с-М вовлечен в регуляцию транскрипции
более 10% от всехизвестных генов.
Соответственно по примерным расчетам у него
может быть более 2500 сайтов связывания по в
сему геному человека. Помимо того, что с-Мyc
регулирует транскрипцию генов,кодирующих
определенные белки, он еще и вовлечен в
регуляцию некодирующих генов микро-РНК

11.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И СВОЙСТВА ИНДУЦИРОВАННЫХ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Однако следует отметить, что ИПС клетки можно получить, используя не только
комбинацию Oct4, Sox2, Klf4 и c-Мyc. Так, вскоре после сообщения о получении
первых ИПС клеток с помощью «коктейля Яманаки», появились данные о том, что
Klf4 и c-myc можно заменить на Nanog и Lin28 , а Sox2 и Klf4 на Sox1 и Klf2. В
дальнейшем работы по получению ИПС клеток развивались, в частности, по пути
повышения эффективности процесса репрограммирования и поиска новых
подходов, в которых не использовались бы вектора, основанные на лентивирусных
или ретровирусных последовательностях, интегрирующихся в геном клетки
реципиента.

12.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И СВОЙСТВА ИНДУЦИРОВАННЫХ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИПС КЛЕТОК

13.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИПС КЛЕТОК

14.

МЕТОДЫ ИНДУКЦИИ ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ
1.ВИРУСНЫЕ
Исторически первыми были вирусные системы индукции:
ретровирусная и лентивирусная трансфекция .
Но клетки, несущие в своем геноме вирусные вставки, не могут применяться для клеточной терапии из-за опа
сности активации трансгенов в организме пациента, что может привести к развитию
злокачественных новообразований.
2.Безвирусные методы индукции плюрипотентности:
ДНК-Транспозоны -которые способны перемещаться как единое целое, при этом происходит
одновременное перемещение лежащих между ними генов. Использование транспозона PiggiBag, который
несет «сшитые» транскрипционные), позволило получить ИПС клетки человека.
• плазмидные
• транскрипционные факторы (Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4)
• эписомы- генетический материал бактерий, в отличие от плазмид они могут втраиваться в хромосомы и пок
идать их
• новейшая разработка с помощью трансфекции соматических клеток матричной РНК (мРНК),
кодирующей указанные выше факторы репрограммирования. Данная методика является безопасной, т.к. мР
НК
полностью разрушается в клетке, а ее синтез in vitro не связан с использованием материалов
животного происхождения

15.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И СВОЙСТВА ИНДУЦИРОВАННЫХ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
ИСТОЧНИКИ ПОЛУЧЕНИЯ ИПС КЛЕТОК
Рис. 3-Фибробласты
Рис. 4-Эритроциты
Рис. 5–Жировые фолликулы
Рис. 6-Гепатоциты
Рис. 7-Лимфоциты
Рис. 8-Эпителий
ИПС клетки могут быть получены из любого
типа соматических клеток организма, но
предпочтение, особенно в случае человека,
будет отдаваться простоте получения. И здесь
фибробласты и кератиноциты кожных
покровов и клетки волосяных фолликулов
вне конкуренции.

16.

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В БИОХИМИЧЕСКИХ И
БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

17.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И СВОЙСТВА ИНДУЦИРОВАННЫХ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
СХОДСТВА И РАЗЛИЧИЯ ЭС И ИПС КЛЕТОК
Рис. 9–СК человека Рис. 10- ИПСК
Существуют функциональные тесты на
плюрипотентность. Самым простым из них
является спонтанная дифференцировка ЭС клеток
in vitro.После культивирования ЭС клеток человека
происходит образование эмбриоидных тел,
а при дальнейшем культивировании в
дифференцирующихся клетках обнаруживается
экспрессия маркеров энтодермы, мезодермы и
эктодермы. Аналогичная картина наблюдается и
При культивировании и дифференцировке ИПС
клеток in vitro.

18.

А. Колония ЭС клеток ч
еловека, линия HUES9.
Б. Колония ИПС
клеток, полученных из
фибробластов
здорового донора.
Увеличение Х200.
В, Г. Иммуноцитохими
ческое окрашивание
клонов ИПС клеток на
маркеры
плюрипотентности.
В.Oct4 (красный), SSEA4
(зеленый), DAPI(голубой)
Г.Sox2(красный),TRA-1-61
(зеленый), DAPI (голубой)
Увеличение Х100.

19.

Спонтанная дифференцировка ИПС
клеток in vitro с образованием
представителей трех зародышевых
листков: эктодермы (А), мезодермы
(Б), энтодермы (В)
.
А. DAPI – голубой, бета-III тубулин – зеленый.
Б. DAPI – голубой, дофаминергические нейроны – желтый.
В. DAPI – голубой, ГАМК-ергические нейроны – зеленый
Нейрональная дифференцировка
ИПС клеток in vitro.
Иммунофлуоресцентная детекция

20.

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В БИОХИМИЧЕСКИХ И
БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
ТЕСТИРОВАНИЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТ
Одной из актуальных проблем современной фармакологии и медицины является создание
эффективных и безопасных лекарственных препаратов, направленных на лечение тех или
иных заболеваний. Для их создания необходимы адекватные, высокопроизводительные и
воспроизводимые, а также относительно дешевые технологии скрининга потенциальных
лекарственных соединений.
Возможность дифференцировки ИПС клеток в кардимиоциты, гепатоциты, фибробласты и
нейроны позволит проводить прицельный доклинический токсикологический скрининг
соединений in vitro

21.

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИХ
КЛЕТОЧНЫЕ МОДЕЛИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА
Особый интерес вызывает моделирование различных нейродегенеративных заболеваний
центральной нервной системы. Это связано с рядом причин. Во-первых,
получение биопсийного материала из мозга человека в обычной практике невозможно и осу
ществляется только при некоторых хирургических операциях, чаще всего связанных с
удалением опухоле.
Во-вторых, взрослые нейроны практически невозможно культивировать in vitro.
В случае использования ИПС клеток, указанные выше трудности можно преодолеть. Так как
ИПС клетки способны практически неограниченное время расти в культуре in vitro, то
можно иметь и необходимое количество клеточного материала для проведения любых
биологических экспериментов.

22.

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ
ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В БИОХИМИЧЕСКИХ И
БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА
Так, в ближайшем будущем планируется начать клинические испытания с
использованием производных ИПС клеток для коррекции ряда заболеваний, таких как
болезнь Албцгеймера, Паркинсона, тромбоцитопения, сердечно-сосудистые
заболевания, рассеянный склероз, поражения сетчатки и травмы спинного мозга. ИПСК,
полученных от пациентов с данными формами болезни могут служить удобной моделью
для изучения данного заболевания и подбора лекарственных средств при лечении дан
ной патологии.

23.

Таким образом, не вызывает сомнений, что перед биологией и медициной
открывается ясная перспектива получения неограниченного числа
специализированных нервных клеток, репрограммированных из соматическ
их
клеток человека. Это знаменует прорыв не только в исследовании различны
х
патологических процессов, скрининга лекарственных препаратов
направленного действия, но и в развитии клеточной трансплантологии –
в связи с возможностью имплантации пациенту генетически идентичных
клеток, полученных из его собственных фибробластов и других
типов зрелых клеток.

24.

Спасибо
за внимание