ЗАНЯТИЕ ЕОП

1.

2.

3.

4.

https://grp-pepcore.embl-community.io/vectors/ecoli.html

5.

6.

Цель:
получение рекомбинантного интерферона-альфа 2В человека в клетках E. coli.
Задачи:
1) Выбрать плазмидный вектор
2) Найти последовательность гена INFα 2B
3) Провести анализ кодонов и при необходимости кодонную оптимизацию
для адаптации к организму-хозяину
4) Ввести последовательности, облегчающие очистку (аффинный тэг и сайт
его отщепления протеазой), сайты рестрикции
5) Провести проверку на наличие нежелательных сайтов рестрикции, при
необходимости – провести вручную точечную кодонную оптимизацию
6) Предложить способ сборки конструкции для вставки в вектор

7.

Плазмидный вектор pBR322
https://www.snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=basic_cloning_vectors&plasmid=pBR322

8.

Плазмидный вектор pBS(+)
https://www.snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=basic_cloning_vectors&plasmid=pBS%28%2B%29
lac-промотор
(индуктор – ИПТГ)

9.

https://www.snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=pet_and_duet_vectors_(novagen)&plasmid=pET-3a

10.

Карту вектора можно найти на сайте https://www.novoprolabs.com/
Resources & Support Vector Maps

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

Поиск последовательности гена интерферона альфа 2b
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/30171278
coding DNA sequence

18.

19.

5’ATGTGTGACCTACCACAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCG
CAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCC
CAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATG
ATCCAGCAGATCTTCAACCTCTTCAGCACAAAAGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACC
CTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTG
ATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTG
AGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCC
TGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAA
AGTTTAAGATCTAAAGAGTAA
3’

20.

21.

http://olig.ru/scripts/01_19.html

22.

23.

24.

25.

CATCATCATCATCATCATGATGATGATGATAAAATGTGTGACCTACCACAAACCCACAGC
CTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCGCAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCC
TGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAA
AAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAACCTCTTCAGC
ACAAAAGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTC
TACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACT
CCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTC
TATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATG
AGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGATCTAAAGAGTAA

26.

27.

Codon Adaptation Tool
http://www.jcat.de/

28.

Только если RBS входит
в проверяемую
последовательность (в
нашем случае не
нужно)

29.

30.

31.

32.

Частичная оптимизация:
Берем для работы эту последовательность

33.

CATCATCATCATCATCATGATGATGATGATAAAATGTGTGACCTGCCACA
AACCCACAGCCTGGGTAGCCGTCGTACCCTGATGCTGCTGGCGCAGATGC
GTCGTATCTCTCTGTTCTCCTGCCTGAAGGACCGTCATGACTTTGGTTTT
CCGCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCGGT
TCTGCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAACCTGTTCAGCACCAAAGACT
CTTCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTGCTGGACAAATTCTACACTGAACTG
TACCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCCTGTGTGATCCAGGGTGTGGGTGT
GACCGAGACTCCGCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGCGTAAAT
ACTTCCAACGTATCACTCTGTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCGTGT
GCCTGGGAGGTTGTTCGTGCAGAAATCATGCGTTCTTTTTCTCTGTCTAC
CAACCTGCAAGAATCTCTGCGTTCTAAAGAGTAA

34.

35.

36.

Необходимо проверить на отсутствие других сайтов рестрикции
для рестриктаз Nde I и BamН I внутри конструкции
http://www.restrictionmapper.org/

37.

Сайты рестрикции для Nde I и BamН I встречаются только по одному разу и
расположены на флангах, других в последовательности гена не содержится, и
оптимизировать не нужно.

38.

39.

Предложите самостоятельно способ получения гена и сборки
конструкции
Для этого см. материалы по темам:
- «ПЦР» (введение сайтов рестрикции, сайт-специфический мутагенез,
сборочная ПЦР);
- «Геномные библиотеки» (библиотеки кДНК)

40.

Способ отбора клонов E. coli, трансфецированных конструкцией с
целевым геном, и подтверждение корректности вставки
Для этого см. материалы по темам:
- «Клонирование ДНК» (отбор клонов);
- «Геномные библиотеки» (скрининг библиотек)

41.

Зачетная работа по теме (стандартное задание)
Создать конструкцию для получения интерлейкина-1 бета (IL-1 ) человека путем экспрессии в
клетках E. coli.
Исходные данные:
Ген ИЛ-1 - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M15330.1
В качестве дополнительной последовательности, облегчающей очистку, использовать пептид
WSHPQFEK (Strep-tag).
В качестве линкера использовать сайт для расщепления фактором свертывания крови Xа.
Вектор pET-9d (найти на сайте https://www.snapgene.com/ или https://www.novoprolabs.com/)
Изучить карту вектора, определить основные структурные элементы, необходимые для
экспрессии целевого белка.
Выбрать сайты рестрикции для вставки гена.
Сконструировать (запланировать) химерную последовательность (см. исходные данные) для
вставки в вектор по выбранным сайтам, провести ее проверку и оптимизацию.
Предложить способ получения этой химерной конструкции.
Предложить штамм, в котором будет осуществляться биосинтез рекомбинантного ИЛ-1 .
Предложить способ отбора клонов E. coli, трансфецированных конструкцией с целевым
геном, а также способ проверки корректности вставки.
Указать метод, с помощью которого будет проводиться выделение химерного белка.
Указать, как будет выделен ИЛ-1 из состава химерной последовательности.
Можно по желанию выбрать самостоятельно другие элементы для создания
конструкции (белок, вектор, дополнительные последовательности).

42.

ВАЖНО:
Из базы для работы
вытаскиваем только CDS –
белок-кодирующую
последовательность, от старт
до стоп-кодона включительно.
Она может быть короче, чем
последовательность мРНК.