Дрожжевая_барокамера_доклад (1)

1.

Задача №6
Дрожжевая
барокамера
Какое давление может создать дрожжевая
Ключевая
идея
• теоретический предел задаётся
ферментация в замкнутом объёме и как его
ограничивают температура, субстрат и
растворённый углекислый газ?
количеством сахара, объёмом жидкости,
объёмом газа и температурой;
• реальный предел ниже из-за
ингибирования дрожжей углекислым
газом, этанолом и осмотическим стрессом;
• поэтому задача сводится к сравнению
химико‑физического потолка и
биологически достижимого давления.
Что покажем в
докладе
• что такое дрожжи и чем отличается
брожение от дыхания;
• как вывести формулу для давления из
баланса CO₂;
• какие параметры нужно менять в пилотном
опыте на отборе.
Команда: «Позовите Андрея Александровича»
1

2.

Что требуется по задаче
Доклад должен быть одновременно биологическим, физико‑химическим и экспериментальным
1. Биология
системы
• что такое дрожжи, какие виды
применяют для получения спирта;
• как дрожжи переходят от дыхания
к брожению;
• какие факторы ограничивают
рост, деление и жизнеспособность
клеток.
2. Модель
давления
• стехиометрия: субстрат → этанол +
CO₂;
• распределение CO₂ между газовой
фазой и раствором;
• влияние температуры, объёма
жидкости и объёма газовой
полости.
3.
Экспериментальный
• серии по температуре,
план
начальному количеству субстрата
и начальному инокулюму;
• безопасный выбор тары и
диапазона дозировок;
• сравнение расчётного давления и
реально достигнутого.
Критерий сильного
турнирного
решения
Не просто назвать
число давления, а разделить два предела: химико‑физический максимум по количеству сахара и
биологически достижимый максимум, ограниченный углекислым газом, этанолом и питанием дрожжей.
2

3.

Что такое дрожжи?
Одноклеточные грибы: удобная модель для управляемого брожения
Кратко
• дрожжи — эукариотические
микроскопические грибы;
• для спиртового брожения чаще
всего используют Saccharomyces
cerevisiae;
• в виноделии и игристых винах
широко применяют штаммы
Saccharomyces cerevisiae var. bayanus;
• для высоких температур и
некоторых субстратов интересен
Kluyveromyces marxianus.
Микрофотография
дрожжей
Почему они
удобны
• быстро делятся почкованием;
Три группы дрожжей
для
задачи
рабочее окно ≈
Saccharomyces cerevisiae
• легко культивируются в простых
средах;
• у них хорошо изучены генетика,
метаболизм и стресс‑ответ.
293–303 K
Жизненный цикл Saccharomyces cerevisiae
3
S. cerevisiae var. bayanus
рабочее окно ≈
285–293 K
Kluyveromyces marxianus
рабочее окно ≈
308–318 K

4.

Дыхание, брожение и молекулярный переход
Для получения давления важен именно переход к анаэробному спиртовому брожению
Два режима
метаболизма
• дыхание: есть кислород, работает цикл трикарбоновых
Ключевые
молекулярные
• ускоренный потокузлы
глюкозы через
кислот и дыхательная цепь;
• брожение: кислорода нет или он ограничен; пируват
переводится в этанол, а НАД⁺ регенерируется без
митохондриального дыхания;
• именно брожение создаёт замкнутый поток CO₂ и рост
давления.
гликолиз;
• образование пирувата;
• декарбоксилирование пирувата и
восстановление ацетальдегида до
этанола;
• регенерация НАД⁺ для продолжения
гликолиза.
Суммарная реакция
для глюкозы
Практический вывод
для
• чемзадачи
быстрее идёт гликолиз, тем быстрее растут
спирт и CO₂;
• чем меньше кислорода после старта, тем ближе
система к чистому брожению;
• при дефиците азота и витаминов давление
занижается уже на ранней стадии.
Для сахарозы после гидролиза суммарный выход
удваивается: 1 моль сахарозы даёт 4 моль CO₂.
Что нужно дрожжам
кроме
сахара
усвояемый
азот, фосфат, Mg²⁺, витамины группы B и
приемлемый pH: поэтому «вода + сахар» почти всегда хуже,
чем полноценная питательная среда.
4

5.

Субстрат и комфортная среда брожения
Под субстратом понимаем исходное вещество, которое дрожжи превращают в продукты брожения
Что может быть
субстратом
глюкоза
самый прямой субстрат
гликолиза
фруктоза
обычна в фруктовых соках
сахароза
после гидролиза даёт глюкозу
и фруктозу
мальтоза
важна для пивных сред
лактоза
обычный S. cerevisiae почти не
использует
Комфорт по
сахаристости
Для стартовых опытов разумно держать
массовую концентрацию сахарозы
порядка 50–150 кг/м³: этого уже хватает
для заметного давления, но
При
200–250 кг/м³
старт
брожения
осмотический
стресс
ещё
не
возможен, но лаг‑фаза растёт и риск
доминирует.
«застревания» заметно увеличивается.
Условия, которые
повышают
выход CO₂
• усвояемый азот;
• фосфат и магний;
• витамины группы B;
• мягкий начальный режим по
осмотическому давлению;
• ограничение кислорода после
разгона культуры.
Условия, которые
тормозят
• слишком густой сироп;
• высокая температура для
выбранного штамма;
• рост растворённого CO₂;
• накопление этанола;
• дефицит питания в системе «вода
+ сахар».
5
Оценка по
литературе
50–100 кг/м³
уверенный
старт
100–150
кг/м³
высокий выход основной
рабочий
CO₂
диапазон
150–200
кг/м³
повышенный
стресс
нужны
хорошие
дрожжи и
питание
>200 кг/м³
риск задержки
и остановки
только для
специальных
штаммов
подходит для
пилота

6.

Почему давление не равно «весь CO₂ в газе»
Вода и растворённый углекислый газ — обязательная часть модели
Баланс CO₂
Что тормозит
дрожжи
При большом объёме жидкости и малом объёме газа
значительная доля CO₂ сначала уходит в раствор.
Поэтому одно и то же количество сахара создаёт разное
давление в почти пустом и почти полном сосуде.
Практический вывод: для роста давления так же
важен не только сахар, но и отношение Vₗ/Vg.
Растворённый
CO₂
подкисляет среду и меняет мембранный
транспорт
Этанол
повреждает мембраны и снижает
жизнеспособность
Осмотическое
давление
растёт при высокой начальной
сахаристости
Температура
ускоряет кинетику, но может снижать
устойчивость
Критический
момент
Даже если клетки ещё живы, рост и деление могут почти
6
прекратиться раньше, чем закончится сахар. В литературе
это видно как остановка герметичного брожения при
наличии остаточного субстрата.

7.

Усреднённая формула для конечного давления
Это модель химико‑физического предела; реальный максимум ниже
1. Количество
образованного углекислого
газа
Что видно из
формулы
при малых концентрациях субстрата
давление растёт почти пропорционально ρₛ,₀;
• при меньшем объёме газовой полости
давление выше;
• понижение температуры обычно
увеличивает растворённую долю CO₂, но
замедляет брожение;
• параметр α зависит от штамма, питания,
этанола и самого CO₂ — именно он делает
теорию биологической.
2. Подставляем газовую фазу и
растворённый CO₂
3. Получаем
давление
Главное
различие
7
pᵗᵉᵒʳ: α = 1; pʳᵉᵃˡ: α < 1.

8.

Что говорит литература: давление, температура,
скорость
Опорные числа для обоснования гипотезы и диапазона опытов
1. Давление и
CO₂‑ингибирование
Kunkee & Ough,
1966
рост и брожение угнетаются давлением CO₂
сильнее при низком pH и высоком этаноле
Norton & Krauss,
1972
деление клеток почти прекращается при pCO₂ ≈
0.28 МПа, но метаболизм ещё идёт
Li et al., 2015
Martí‑Raga et al.,
2015
2. Температурные окна трёх
групп дрожжей
Штамм
285 K
293 K
303 K
313 K
S. cerevisiae
низк.
средн.
высок.
резкий
спад
S. bayanus
средн.
высок.
средн.
спад
K. marxianus
почти нет
средн.
высок.
высок.
герметичное винное брожение останавливается
при pCO₂ ≈ 1.43 МПа и остаточном сахаре
Обобщённый
вывод
• оптимум температуры зависит от вида и штамма;
• для обычных спиртовых штаммов разумно
тестировать 288–303 K;
• рост инокулюма X₀ сильнее влияет на время
достижения плато, чем на само конечное давление.
вторичное брожение игристых вин штатно
работает в области 0.46–0.59 МПа
8

9.

Гипотеза и простая динамическая модель
Нужно объяснить не только конечное число, но и форму кривой давления
Гипотеза
Как будет выглядеть
кривая p(t)
• при малом количестве сахара pₘₐₓ почти
пропорционально начальному количеству
субстрата;
• при росте сахаристости и давления доля α
уменьшается из‑за самоингибирования;
• температура ускоряет набор давления до
некоторого оптимума, после чего устойчивость
дрожжей падает.
p
плато
ускорение
Минимальная
кинетическая схема
Здесь fₛ, fCO₂ и fEtOH — безразмерные множители, которые
уменьшают скорость при осмотическом, углекислом и
спиртовом стрессе.
лаг‑фаза
t
Теория предсказывает: повышение X₀ в основном сокращает
лаг‑фазу, а повышение ρₛ,₀ увеличивает плато только до
начала сильного ингибирования.
9

10.

Модели эксперимента: температура и
начальный
субстрат
Отборочный этап можно закрыть расчётом и пилотной серией на малых объёмах
Опыт Т‑1: серия по
температуре
• сосуд: 1.5×10⁻³ м³, из них 1.2×10⁻³ м³ жидкости и
Опыт S‑2: как выбрать дозировку
для
паспортного
ферментера
Для сосуда
0.03 м³ с 0.021
м³ жидкости и 0.009 м³
газовой полости при 293 K:
3.0×10⁻⁴ м³ газа;
• сахароза: 10 кг/м³; дрожжи: 0.5 кг/м³ сухих дрожжей;
есть минимальная подкормка;
• температуры: 288 K, 298 K и 303 K;
• ожидание по теории: pᵗᵉᵒʳ почти одинаково, но
скорость выхода на плато максимальна около 298–303
K.
10
15
pᵗᵉᵒʳ, МПа
0.13
0.27
0.40
0.20
0.24
Нужная ρₛ,₀, кг/м³
4.8
9.7
11.6
Что можно реально
отбораи откалибровать манометр;
•успеть
собратьдо
установку
ρₛ,₀. При α = 1 теория даёт:
5
0.10
То есть для сосуда с рабочим пределом 0.24–0.25 МПа не
нужен густой сироп: безопаснее задавать давление
дозировкой сахара.
Опыт S‑1: серия по
сахарозе
Те же объёмы и температура 298 K; меняем только
ρₛ,₀, кг/м³
Цель по давлению,
МПа
• показать старт брожения и рост давления на
малых дозировках;
• основной максимум пока обосновать расчётом и
литературой.
Реально измеренное давление будет ниже, потому что
α < 1.
10

11.

Модели эксперимента: начальный инокулюм и
выбор
тары
Начальное количество дрожжей влияет в основном на время, а не на химический потолок
Опыт X‑1: ряд по
начальному
инокулюму
• объёмы и состав
среды такие же, как в опыте Т‑1;
Тара: что подходит, а
что нет
• сахароза 10 кг/м³; температура 298 K;
• X₀ = 0.25, 0.50, 1.0 и 2.0 кг/м³ сухих дрожжей;
• ожидание: лаг‑фаза сокращается, но pₘₐₓ меняется
заметно слабее, чем время выхода на плато.
Прогноз по
литературе
X₀, кг/м³
0.25
0.50
1.0
2.0
Время до заметного
роста p
самое
долгое
короче
ещё
короче
почти без
выигрыша
Ожидаемое pₘₐₓ
≈
≈
≈
≈
Обычная бутылка для
воды
нет
не является штатной тарой
давления
Бутыль для кулера
нет
нет паспортного рабочего
режима как у барокамеры
ПЭТ из‑под газировки
только
пилот
только малые дозировки и
защитный контейнер
Паспортный ферментер
/ кег
да
только в такой таре имеет
смысл искать максимум
Безопасная
стратегия
Для отбора: маленькая ПЭТ‑бутылка из‑под газировки
как пилотный реактор. Для реального поиска
максимума: только паспортная тара с манометром и
клапаном.
11

12.

Выводы и логика доклада на турнире
Как завершить выступление так, чтобы было видно и теорию, и план будущего эксперимента
Пять
выводов
• дрожжевая ферментация может создавать
Что стоит подчеркнуть в
полемике
значительное давление, но максимум зависит не
только от сахара;
• существенная часть CO₂ растворяется в жидкости,
поэтому обязательно нужны Vₗ, Vg и закон Генри;
• реальное давление ниже стехиометрического из‑за
фактора α: CO₂‑ингибирование, этанол и
осмотический стресс;
• начальный инокулюм меняет главным образом
время, а не химический предел;
• искать настоящий максимум можно только в
паспортной таре давления.
Структура
8‑минутного
1 мин — задача идоклада
гипотеза; 2 мин — что такое дрожжи и
брожение; 2 мин — вывод формулы; 2 мин — литература
и модель опытов; 1 мин — безопасность, выводы и что
будет проверено экспериментом дальше.
Почему нельзя брать просто
очень много сахара?
осмотический стресс и падение
α
Почему не вся теория уходит
в давление?
часть CO₂ растворяется в воде
Почему нельзя оценивать
сосуд «на глаз»?
нужен паспорт рабочего
давления
Почему у статьи Li
получилось 1.43 МПа?
богатая винная среда и
герметичный жёсткий сосуд
Финальная
формулировка
12
Максимум давления задаётся не
одной цифрой, а парой
«теоретический потолок —
реально достижимое давление».