Общая характеристика соединений. Подгруппа «Лекарственные вещества»

1.

Министерство здравоохранения Российской Федерации
Красноярский государственный медицинский университет
имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого
Кафедра биохимии с курсами медицинской,
фармацевтической и токсикологической химии
Лекция для обучающихся по
специальности 33.05.01 Фармация
Основы изолирования токсикантов
из биологического материала
методом экстракции
Канд. биол. наук, доцент
В.А. Кутяков, 2026 год

2. Общая характеристика соединений. Подгруппа «Лекарственные вещества»

Вещества кислотного характера:
1) Органические кислоты: бензойная, салициловая, пикриновая, их
производные.
2) Барбитураты: барбитал, фенобарбитал, барбамил, этаминал-Na,
бутобарбитал, гексенал, бензонал, бензобамил, циклобарбитал и др.
Вещества нейтрального характера:
1) Небарбитуровые снотворные: ноксирон, тетридин.
2) Сердечные гликозиды.
3) Многоатомные фенолы: гидрохинон, пирогаллол.
4) Полинитропроизводные: м-динитробензол, динитротолуолы,
тринитротолуол.
5) Производные анилина и п-аминофенола: фенацетин, пфенилендиамин.

3.

Вещества основного характера:
1) Алкалоиды: производные пиридина и пиперидина
(жидкие алкалоиды), тропана (атропин, кокаин и др.),
хинолина (хинин), изохинолина (опийные), индола (стрихнин,
бруцин, резерпин), пурина (кофеин, теобромин, теофиллин),
пирролизидина (платифиллин, саррацин), ациклические
(эфедрин), стероидоподобные (вератрин) и неустановленного
строения (аконитин).
2) Синтетические вещества основного характера:
антипирин, амидопирин - производные пиразола, промедол производное пиперидина, новокаин и дикаин - производные
аминокислот ароматического ряда, изониазид, производные
фенотиазина, производные 1,4-бензодиазепина и т.д.

4.

Цели подготовки образца (пробоподготовки)
Достижение совместимости аналита с аналитической системой
посредством:
• солюбилизации/гомогенизации твердых веществ/эмульсий и т. д.,
• разрушение конъюгатов токсикантов с белками,
• добавление внутреннего стандарта,
• удаление нерастворимых остатков/мешающих соединений,
• концентрирование/разбавление аналита,
• гидролиз конъюгатов,
• стабилизации, разложения и/или дериватизации аналита для
улучшения экстракционных, хроматографических и/или
детектирующих свойств.

5.

Режимы подготовки образцов
Твердые вещества/ткани
• физическое разрушение (гомогенизация, ультразвуковая обработка,
нагревание/микроволновая обработка),
• химическое разрушение (ферменты, кислотная/щелочная обработка).
Жидкости
• прямой анализ после обработки в автономном режиме (фильтрация,
добавление ISTD, осаждение белка),
• прямой «онлайн» анализ,
• анализ парофазного пространства (HS) (также продувка/улавливание,
микродиффузия),
• жидкостно-жидкостная экстракция (LLE),
• поддерживаемая жидкостная экстракция (SLE),
• твердофазная экстракция (SPE), также известная как сорбционная экстракция
(SE),
• твердофазная микроэкстракция (SPME) жидкости или парофазного
пространства,
• жидкофазная микроэкстракция (LPME),
• сверхкритическая флюидная экстракция (SFE) твердой матрицы,
• ускоренная экстракция растворителем (ASE.)

6.

Рекомендации
Избегать
Сделать анализ максимально простым
Ненужные добавки (например, консерванты)
Использовать высококачественные реагенты,
растворители и т. д.
Использование внутренних стандартов, если они
снижают точность
Учитывать клиническую фармакологию,
метаболизм и токсикологию аналита
Опасные по возможности, токсичные/опасные
реагенты
Использовать наименьший образец,
совместимый с требуемой
чувствительностью/селективностью анализа
Использование большего количества образца,
чем необходимо
Увеличение размера образца/объема для
повышения чувствительности, если необходимо
Использование экстракционного растворителя,
который слишком «мощен» для приложения
Использование внешних стандартов в цветовых
тестах, УФ/видимой спектрофотометрии и ТСХ
Использование ненужных экстремальных
значений тепла или pH ТФЭ, если ЖЖЭ
удовлетворительна
Использование внутренних стандартов в ГХ, ЖХ
и МС
Разработка сверхчувствительных методов

7. Использование экстракции

8. Изолирование токсикантов методом экстракции

Экстракция
—
процесс
извлечения
растворителями соответствующих веществ из
различных объектов. Объекты, из которых
извлекают соответствующие соединения, могут
быть твердыми веществами и жидкостями.
Поэтому процессы извлечения подразделяют на
экстракцию в системе твердое тело - жидкость
(твердофазную) и на экстракцию в системе
жидкость - жидкость (жидкость – жидкостную)
экстракцию.

9. Изолирование токсикантов методом экстракции

Для
экстракции веществ в системе
твердое тело - жидкость в качестве
экстрагентов применяют органические
растворители.
Извлечение соответствующих веществ
из твердых тел водой называется
выщелачиванием.

10. Изолирование токсикантов методом экстракции

Процесс
экстракции
(выщелачивания)
целевых
компонентов из биологического материала является
многостадийным. Основными стадиями этого процесса
являются:
- проникновение экстрагента в клетки и ткани трупного
материала и в другие объекты, в которых находится
исследуемое вещество,
- растворение целевого компонента в экстрагенте или
взаимодействие целевого компонента с экстрагентом в
клетках и тканях биологического материала,
- перенос растворенного целевого компонента через
оболочки клеток в межклеточное пространство,
- смешивание извлеченных из клеток веществ с основной
массой экстрагента.

11. Стадии процесса изолирования

1. Настаивание биоматериала с водой
(этанолом)
Переход токсиканта из биоматериала в
подкисленную воду (этанол) после настаивания
2. Экстракция токсиканта в органический
растворитель
Переход токсиканта из подкисленной воды в
хлороформ (после экстракции)

12. Факторы, влияющие на эффективность изолирования «нелетучих» ядов из биоматериала

На первой стадии:
1) Растворимость токсиканта в используемом
экстрагенте, которая определяется степенью ионизации α
и регулируется рН среды
рН = рКα + 2(3) для кислот
рН = рКα - 2(3) для оснований
2) Экстрагент
- Способность легко проникать в клетки тканей.
- Высокая растворяющая способность (по отношению к
токсиканту).
- Селективность (по отношению к анализируемым
соединениям).
3) Степень измельченности объекта

13. На второй стадии: 1) Растворимость токсиканта, которая определяется степенью ионизации α и регулируется рН среды. рН = рКα -

2(3) для кислот
рН = рКα + 2(3) для оснований
2)
Природа экстрагента, его объем, время и кратность
экстракции.
- Не смешиваются с водой и по плотности ( ) значительно
отличаются от нее.
- Имеют низкую температуру кипения.
- Хорошо растворяют изолируемое вещество и
обеспечивают высокий коэффициент распределения его между
водной и органической фазами.

14. Изолирование токсикантов методом экстракции

Жидкостная
экстракция
—
процесс
распределения растворенного вещества между
двумя несмешивающимися жидкими фазами,
одной из которых в большинстве случаев
является вода, а второй - несмешивающийся с
водой органический растворитель.
Извлечение вещества из фазы органического
растворителя в водную фазу называется
реэкстракцией.

15. Изолирование токсикантов методом экстракции

Переход экстрагируемого вещества из
одного растворителя в другой происходит
в результате разности концентраций и
неодинаковой
растворимости
этого
вещества в обоих растворителях. Этот
процесс происходит до тех пор, пока не
наступит
равновесие
концентраций
извлекаемого вещества в одном и другом
растворителях.

16. Изолирование токсикантов методом экстракции

Экстрагируемость химических соединений
зависит от растворимости их в воде и в
несмешивающихся с водой органических
растворителях,
применяемых
для
экстракции. Подтверждением этого является
то,
что
коэффициент
распределения
некоторых веществ приблизительно равен
отношению
их
растворимостей
в
органическом растворителе и в воде.

17. Изолирование токсикантов методом экстракции

В настоящее время под экстрагентом
понимают органический растворитель
(содержащий или не содержащий другие
компоненты), который извлекает вещество
из водной фазы.
Составная часть экстрагента, химически
взаимодействующая
с
извлекаемым
веществом, называется реагентом.

18. Изолирование токсикантов методом экстракции

В зависимости от состава и свойств
экстрагентов
экстракционные
системы
подразделяются на две группы.
К первой группе относятся экстракционные
системы с так называемым «физическим»
распределением компонентов. В этих
системах
отсутствует
химическое
взаимодействие
между
экстрагентом
(органическим
растворителем)
и
экстрагируемыми веществами.

19. Изолирование токсикантов методом экстракции

Ко второй группе относятся экстракционные
системы, в которых экстракция осуществляется
за
счет
химического
взаимодействия
извлекаемых
веществ
с
экстрагентами.
Эффективность разделения веществ в таких
системах зависит от прочности образующихся
соединений
или
комплексов.
Эти
экстракционные системы используются для
извлечения неорганических веществ.

20. Свойства «идеального» экстракционного растворителя

• Хорошая «экстрагирующая способность»
• Низкая растворимость в воде
• Плотность ниже, чем у воды
• Умеренная летучесть для облегчения удаления путем испарения,
но не настолько летучий, чтобы испаряться во время подготовки
образца
• Стабильный/инертный (не содержит добавленных
стабилизаторов)
• Низкая воспламеняемость
• Низкая токсичность (все способы поступления)
• Недорогой и легкодоступный в требуемой квалификации
• Отсутствие поглощения УФ-излучения или электрохимической
активности
• Отсутствие реакции/вредного воздействия на детекторы ГХ

21.

Опасные факторы,
связанные с использованием некоторых растворителей
Растворитель
Опасность
Бензол
Канцероген для человека
Дисульфид углерода
Нейротоксин
Четыреххлористый углерод,
хлороформ
Гепаторенальные токсины; известные
канцерогены
ДХМ
Карбоксигемоглобинемия; возможный
канцероген
Диэтиловый эфир
Легко воспламеняется; может
образовывать взрывоопасные пероксиды
Гексан, 2-гексанон
Периферические нейротоксины
Трихлорэтилен
Кардиотоксин

22. Величины для описания процесса экстракции

23. Схема процесса экстракции

24. Устройства для проведения экстракции

25. Твердофазная экстракция

Твердофазная экстракция (ТФЭ) (Solid
Phase Ecstaction (SPE) )- это быстрый
метод пробоподготовки, в котором
применяется сорбент (твердая
неподвижная фаза) для концентрирования
и отделения целевого компонента или
компонентов с последующим
элюированием (вымыванием) подходящим
растворителем.

26.

Прекрасной альтернативой жидкость-жидкостной экстракции
является твердофазная экстракция. Пробы большого объема могут
быть обработаны с использованием сравнительно малых
количеств твердой фазы, что в свою очередь требует малого
объема растворителей для последующей десорбции
сконцентрированных соединений, следовательно, отсутствует
необходимость дополнительного выпаривания, существенно
уменьшается риск загрязнения образца.
Для ТФЭ характерны более широкие возможности варьирования
природы и силы взаимодействий образца с сорбентом и элюентом.
За счет специфических взаимодействий можно селективно
концентрировать и извлекать каждое из определяемых соединений
или отделять их от мешающих компонентов.

27. Преимущества ТФЭ

высокая степень извлечения целевых
соединений(> 75%),
отличная воспроизводимость,
селективность и специфичность - чистые
экстракты,
существенное снижение времени пробоподготовки
по сравнению с жидкостно-жидкостной
экстракцией,
возможность оптимизации процесса,
простота в использовании,
экономия дорогих растворителей.

28. Этапы подготовки образцов ТФЭ

Схема процедуры ТФЭ (Analytical Toxicology, 2020)

29. QuEChERS пробоподготовка

Процедура QuEChERS (Quick, Easy, Cheap,
Effective, Rugged and Safe - Быстрый,
Простой, Дешевый, Эффективный, Точный
и Надежный) – универсальный метод
подготовки проб, позволяющий извлечь
остаточные количества органических
соединений, принадлежащих к разным
классам химических соединений за один
прием в несколько простых этапов.

30.

Наборы по методу QuEChERS делают
предлагаемый метод более простым,
надежным, времясберегающим за счет
оптимального состава реагентов,
обеспечивающих максимальное
извлечение микроколичеств целевых
веществ, сокращения количества
лабораторных операций, уменьшения
количества применяемых химических
реактивов и лабораторной посуды.

31. Этапы QuEChERS

Первый этап: Экстракция

32. Этапы QuEChERS

Второй этап: Очистка ТФЭ Насыпным сорбентом

33. Характеристика методов

34. Изолирование токсикантов методом экстракции

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ИЗОЛИРОВАНИЯ
Для изолирования «лекарственных» токсикантов используют
общие и частные методы.
Общие методы изолирования:
- экстракция водой, подкисленной щавелевой кислотой (по А.В.
Васильевой);
- экстракция этанолом, подкисленным щавелевой кислотой (по
Стасу-Отто);
- экстракция ацетоном или ацетонитрилом (по В.А. Карташову).

35.

Частные методы изолирования токсикантов:
- Изолирование алкалоидов водой, подкисленной серной
кислотой (метод В.Ф. Крамаренко).
- Изолирование метаболитов производных 1, 4бенздиазепина (метод Б.Н. Изотова).
- Изолирование барбитуратов водой, подкисленной серной
кислотой (метод В.И. Поповой).
- Изолирование производных фенотиазина подкисленным
ацетонитрилом (метод Е.М. Саломатина).
- Изолирование барбитуратов подщелоченной водой (метод
П. Валова).

36.

Изолирование токсикантов экстракцией полярными растворителями
включает такие этапы:
1. Пробоподготовка: измельчение органов трупа с помощью ножниц,
мясорубки, гомогенизатора.
2. Взятие навески (1-100 г в зависимости от содержания токсиканта в
объекте и чувствительности метода).
3. 3-разовая экстракция токсиканта подкисленным растворителем
или без подкисления.
4. Объединение экстрактов, процеживание, центрифугирование
(последнее при необходимости).
5. Экстракция токсиканта из кислой среды органическим
растворителем - получение «кислого» извлечения.
6. Экстракция токсиканта из щелочной среды органическим
растворителем - получение «щелочного» извлечения.

37.

Изолирование подкисленным этанолом (метод Стаса-Отто)
• Настаивание
измельченного
объекта
с
этиловым
подкисленным щавелевой кислотой до рН 2-3, в течение суток.
спиртом,
• Упаривание объединенных спиртовых извлечений при температуре 4050°С до густого остатка, в который затем по каплям добавляют
абсолютный этанол для коагуляции белков.
• Упаривание фильтрата при той же температуре до густого остатка и
разбавление горячей водой для удаления смолистых веществ, жиров и
пигментов.
• Экстрагирование веществ кислого, нейтрального и слабоосновного
характера из водного фильтрата хлороформом при рН 2 (трехкратная
экстракция), отделение органической фазы и концентрирование
полученного извлечения упариванием (фракция А, «кислое» извлечение).
• Подщелачивание оставшегося после разделения фаз водного слоя до рН
9-10, экстрагирование веществ сильноосновного характера (трехкратная
экстракция)
хлороформом,
отделение
органической
фазы
и
концентрирование упариванием (фракция Б, «щелочное» извлечение).

38.

Достоинства метода:
1. Метод универсален, т.к. этанол является хорошим
растворителем для многих веществ этой группы (как
ионизированных, так и молекулярных форм).
2. Метод предусматривает очистку извлечения от
балластных веществ.
Недостатки метода:
1. Длительность (8-10 рабочих дней) и многостадийность.
2. Потери искомых веществ.
3. Сравнительная дороговизна метода.

39.

Изолирование водой, подкисленной щавелевой кислотой (метод А.
Васильевой)
• Настаивание измельченного объекта с водой,
щавелевой кислотой до рН 2-3, в течение двух часов.
подкисленной
• Экстрагирование веществ кислого, нейтрального и слабоосновного
характера из водного фильтрата эфиром (хлороформом) при рН 2
(трехкратная экстракция), отделение органической фазы и
концентрирование полученного извлечения упариванием (фракция
А, «кислое» извлечение).
• Подщелачивание оставшегося после разделения фаз водного слоя
раствором аммиака до рН 9-10, экстрагирование веществ основного
характера трехкратной экстракцией хлороформом, отделение
органической фазы и концентрирование упариванием (фракция Б,
«щелочное» извлечение).

40.

Достоинства метода:
1. Быстрота (анализ можно провести в течение одного рабочего
дня).
2. Меньшее количество операций, меньшие потери искомых
веществ.
3. Экономичность и дешевизна.
Недостаток метода:
Образование стойких эмульсий при экстрагировании веществ из
водной фазы хлороформом.

41.

Изолирование барбитуратов
(метод П. Валова)
подщелоченной
водой
•Настаивание
измельченного объекта
с
водой,
подщелоченной 20% раствором гидроксида натрия до
рН 10 и более, в течение 30 минут.
•Очистка водного извлечения путем насыщения
вольфраматом натрия в кислой среде (H2SO4) до рН 2,
фильтрование раствора.
•Экстрагирование эфиром, концентрирование эфирного
извлечения упариванием.

42.

Достоинство метода:
Метод дает достаточно чистые извлечения,
т.к. включает стадию очистки (осаждение
белков вольфраматом натрия), что повышает
качество последующего анализа.
Недостаток метода:
Соосаждение барбитуратов с белками при
обработке вольфраматом натрия.

43.

Частный метод изолирования алкалоидов водой, подкисленной
серной кислотой (по В.Ф. Крамаренко)
• Настаивание измельченного объекта с водой, подкисленной
20% раствором серной кислоты до рН 2-3, в течение двух
часов.
• Очистка водного извлечения от белковых соединений путем
насыщения его сульфатом аммония, настаивания в течение
часа и фильтрования образовавшегося осадка.
•Очистка фильтрата от жиров, смол, пигментов путем
экстракции эфиром. Эфирное извлечение отбрасывают.
•Подщелачивание водного извлечения 20% раствором
гидроксида натрия и экстрагирование веществ основного
характера хлороформом при рН 9-10 (трехкратная
экстракция),
отделение
органической
фазы
и
концентрирование полученного извлечения упариванием.

44.

Достоинства метода:
1. Быстрота
2. Хорошая очистка извлечений от соэкстрактивных
веществ.
Недостаток метода:
Потеря искомых веществ из-за соэкстракции на
стадии очистки.

45.

46. ОЧИСТКА ИЗОЛИРУЕМЫХ ВЕЩЕСТВ ОТ СОПУТСТВУЮЩИХ КОМПОНЕНТОВ БИОМАТЕРИАЛА

Соэкстрактивные вещества мешают проведению анализа:
1. Маскируют окраску при проведении реакций окрашивания
(обугливание
соэкстрактивных
веществ
под
действием
концентрированной серной кислоты).
2. Снижают чувствительность микрокристаллических реакций и
приводят к образованию кристаллов неправильной формы, либо к их
полиморфизму (многообразие форм).
3. Искажают спектры веществ при исследовании в УФ - и ИК-областях.
4. Дают завышенные
веществ.
результаты
количественного
определения
5. Многие продукты гнилостного разложения биоматериала дают такие
же реакции, как и некоторые токсиканты.

47.

На 1 этапе изолирования:
1. Удаление механических загрязнений (мелких частиц
биоматериала) фильтрованием или центрифугированием.
2. Осаждение примесей при добавлении соответствующих
реагентов, например, осаждение белков абсолютным спиртом,
ацетоном,
трихлоруксусной
кислотой,
вольфрамовой,
фосфорно-вольфрамовой,
фосфорно-молибденовой
кислотами, насыщение электролитами (Na2SO4, (NN4)2SO4,
NaCl).
3. Изменение состава фаз, т.е. введения другого органического
растворителя.

48.

На 2 этапе изолирования или после него:
1. Реэкстракция, т.е. переведение веществ из одной
жидкой фазы в другую при изменении рН раствора.
2. Сублимация - для веществ, способных возгоняться без
разложения при нагревании (салициловая кислота,
бензойная кислота, барбитураты, жидкие алкалоиды).
3. Хроматография - ионообменная, гель-хроматография,
адсорбционная
хроматографии
на
колонках,
тонкослойной хроматография.

49.

Что происходит с белками
при их осаждении разными реагентами?

50. ВЕЩЕСТВА, ЭКСТРАГИРУЕМЫЕ ОРГАНИЧЕСКИМИ РАСТВОРИТЕЛЯМИ ИЗ КИСЛЫХ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ

51.

В этой группе токсикантов наиболее
важное токсикологическое значение
имеют:
- производные барбитуровой кислоты,
- производные ксантина,
- отдельные алкалоиды,
другие токсиканты (салициловая,
бензойная кислоты и их производные).

52.

Фармакологические свойства
Производные
барбитуровой
кислоты
применяются в качестве успокаивающих и
снотворных средств.
Бензонал – в качестве противоэпилептического
средства.

53.

По
продолжительности снотворного действия
барбитураты можно разделить на 3 группы:
Препараты
длительного действия (барбитал,
барбитал-натрий, фенобарбитал).
Препараты
со средней продолжительностью
действия (этаминал-натрий, барбамил).
Препараты
кратковременного
действия
(гексобарбитал, гексенал, тиопентал-натрий).

54.

55.

Барбитуровая кислота является циклическим уреидом и может
рассматриваться
как
производное
пиримидина
(2,4,6триоксипиримидин). Атомы водорода метиленовой группы в 5-ом
положении пиримидинового цикла, а также водород, стоящий у
атомов азота в 1 и 3 положениях, подвижны и способны
замещаться различными органическими радикалами, атом
кислорода в положении 2 также способен замещаться на атом S.
Общую формулу барбитуратов можно изобразить следующим
образом:
O
R1
C
C5
R2
O
C6
4
3 NH (R3)
2
1
N
H
C
O (S)
где R1, R2, R3 – радикалы, содержащие от 1
до 7 атомов углерода

56. Классификация барбитуратов

1) 5,5 -замещенные производные (двузамещенные)
1. Барбитал R1 и R2-C2H5
2. Фенобарбитал R1 - С2Н5, R2 - С6Н5
3. Барбамил R1 -C2H5, R2 –СН2-СН2-СН(СН3)2
4. Этаминал-натрий R1-C2H5, R2 – С3Н5-(СН3)2
5. Бутобарбитал R1 - С2Н5, R2- C4Н9

57.

II. N-замещенные барбитураты (трехзамещенные):
1. Гексенал
R1 –СН3
R3 –CH3
R2 – C6H5
2. Бензонал R1-C6H5
R2-C6H5
R3 –CO-C6H5
3. Бензобамил R1-C2H5
R2 –CH2-CH2-CH -(CH3)2
R3=
C
C6H5
O
III. Тиобарбитураты (атом кислорода во 2 положении
замещен на атом серы)
1. Тиопентал-натрий R1 -C2H5

58. БАРБИТУРАТЫ И МЕТОДЫ ИХ ИССЛЕДОВАНИЯ

По физическим свойствам все барбитураты представляют
собой белые кристаллические вещества без запаха,
горького вкуса, лишь тиопентал имеет желтоватый оттенок
и обладает слабым запахом серы.
Кислотные
(молекулярные)
формы
барбитуратов
растворимы в эфире, хлороформе, спирте и некоторых
других
органических
растворителях,
натриевые
производные – в воде.
Барбитураты имеют высокие температуры плавления,
возгоняются без разложения, что используется для их
очистки от посторонних примесей при выделении из
биоматериала.

59. Таутомерия барбитуратов

В
водных растворах барбитураты обладают кислотными
свойствами (рКа 7-8). Это объясняется тем, что барбитураты в
зависимости от рН среды способны существовать в нескольких
таутомерных формах (имидо-имидольная или лактим-лактамная
таутомерия):
O
OH
R1
NH
R2
O
R1
pH=2
имидная
форма
O
O
R1
N
R2
N
H
OH
N
H
pH=10
имидольная
форма
N
R2
O
O
N
OH
pH=13
диимидольная
форма

60.

Кислотные свойства обусловлены тем, что атомы водорода
гидроксильных групп способны отщепляться в виде ионов,
подобно тому, как это происходит в фенольном гидроксиле,
и замещаться на атом Ме, образуя солеобразные
соединения.
Способность барбитуратов существовать в нескольких
таутомерных формах и различная растворимость этих форм
в воде и органических растворителях используется для их
изолирования и очистки при выделении из биоматериала.
На этом же свойстве барбитуратов основано их
исследование в УФ-области спектра, т.к. таутомерные
формы обладают различным светопоглощением.

61. Химико-токсикологическое исследование барбитуратов

Этапы исследования:
1. Изолирование из объекта.
2. Очистка полученного извлечения.
3. Идентификация.
4. Количественное определение.

62.

этап. Выбор метода изолирования определяется
характером объекта и поставленными перед химиком
задачами.
Для целей клинического исследования в случае острых
отравлений, а также в судебно-химической практике,
когда объектами исследования являются промывные воды
желудка, диализат, небольшое количество крови и мочи,
извлечение барбитуратов проводится непосредственно
экстракцией органическим растворителем.
1

63.

При исследовании трупного материала (внутренних органов):
а) при общем (ненаправленном) судебно-химическом анализе
изолирование барбитуратов проводится подкисленным
спиртом и подкисленной водой. Последующая экстракция их
из кислого водного раствора осуществляется органическим
растворителем, чаще эфиром или хлороформом. Изолирование
подкисленной водой и подкисленным спиртом обеспечивает
выход барбитуратов порядка 25-30% (некоторые барбитураты
изолируются этанолом на 50% - барбамил, этаминал-Na,
фенобарбитал).
б) При специальном (частном, направленном) исследовании
на производные барбитуровой кислоты проводят извлечение
подщелочённой водой по методу П. Валова. Выход
барбитуратов 49-52% при достаточной чистоте выделенных
веществ.

64.

При специальном задание на бензонал:
Бензонал
метаболизирует в организме и в трупном
материале на фенобарбитал и бензойную кислоту, поэтому
методика исследования предусматривает извлечение как
нативного вещества, так и продуктов метаболизма и
дальнейшее исследование на их наличие.
Максимальное количество бензонала извлекается из
органов методом Т.А. Чернобровиной.

65. Идентификация и количественное определение барбитуратов

66.

Для идентификации барбитуратов используют химические,
физические и физико-химические методы анализа.
Химические методы (образование окрашенных соединений).
Наиболее известны следующие реакции:
1. С солями кобальта в щелочной среде. В результате реакции
образуется комплекс состава Co(NH3)6OHBarb2, окрашенный в
красно-фиолетовый цвет. Реакция неспецифична для барбитуратов.
Её могут давать и другие соединения, по химическому строению
сходные с барбитуратами (теобромин, теофиллин, биурет,
некоторые сульфаниламиды).
2. С солями меди в присутствии пиридина образуется комплекс
состава СuРуг2 Вагb2) красно-фиолетового цвета (тиобарбитураты
- зеленого цвета).
3. С солями ртути в присутствии дифенилкарбазона (ДФК)
барбитураты образуют комплексные соединения, окрашенные в
сине-фиолетовый цвет. Реакция широко используется для
обнаружения барбитуратов на хроматограмме. Чувствительность
ее достигает 0,5 мкг. Реакция неспецифична для барбитуратов.
4. Мурексидная проба (дают также пуриновые алкалоиды).

67.

Микрокристаллические реакции
Барбитураты
образуют
характерные
кристаллические осадки при взаимодействии с солями
тяжелых металлов (хлорцинкйодом, железо- и меднойодидным комплексами, медно-пиридиновым реактивом)
и выпадать в осадок из растворов концентрированной
серной кислоты при понижении ее концентрации
(выделение кислотной формы барбитурата).
Формы образующихся кристаллов характерны для
каждого отдельного барбитурата. Чувствительность
реакции достигает десятых долей мкг.

68.

Обладая высокой чувствительностью, доказательностью и
специфичностью, микрокристаллические реакции не
лишены и ряда недостатков:
- их проведение требует высокой степени чистоты
исследуемого вещества, наличие примесей снижает
чувствительность реакции, а также мешает правильной
кристаллизации;
- производные барбитуровой кислоты склонны к
полиморфизму образующихся кристаллов. В зависимости
от ряда факторов - концентрации вещества, скорости
кристаллизации, температуры, наличия посторонних
примесей - барбитураты способны образовывать кристаллы
различной формы, что затрудняет идентификацию
отдельных веществ по форме кристаллов.

69. Физические и физико-химические методы анализа

Физические и физико-химические методы:
ТСХ, ВЭТСХ, ВЭЖХ, спектроскопия в УФ- и ИК- oбластях
спектра.
Хроматография в тонком слое используется в качестве
предварительного испытания на наличие производных
барбитуровой кислоты:
- возможность разделения и идентификации бaрбитуратов при
их совместном присутствии (сочетанное отравление);
- отделение барбитуратов от их метаболитов;
- очистка полученного извлечения от балластных веществ.

70.

Спектроскопическое
исследование
барбитуратов чаще проводят в области
длин волн 200-400 нм, т.е. в УФ-области
спектра, получая электронные спектры
поглощения (что обусловлено наличием
в структуре системы хромофоров и
ауксохромов).
Способностъ барбитуратов к абсорбции
в
УФ-области
связана
с
их
таутомерными превращениями.

71.

Для 5,5-замещенных производных:
1. Имидная форма (рН 2) не абсорбирует в УФ области,
т.к. здесь отсутствует хромофорная система (система
сопряженных простых и двойных связей).
2. Имидольная форма (рН 10) уже имеет такую систему и
обладает характерным поглощением с lmах=240 нм.
3. Диимидольная форма также обладает характерным
поглощением с lmах=255-260 нм. Здесь происходит
удлинение хромофорной системы за счет образования еще
одной двойной связи и, соответственно этому
батохромный сдвиг максимума (в длинноволновую
область).

72.

Трехзамещенные производные:
Имеют лишь одну ионизированную форму (имидольную), поэтому их
поглощение не меняется с переходом от рН 10 к рН 13, и они обладают одним
максимумом в щелочной среде при длине волны 245 нм.
Тиобарбитураты:
Имеют два максимума в кислом растворе (239 и 290 нм), в щелочном при
рН=10 также два максимума (255 и 310 нм) и при рН 13 - один (310нм).
Таким образом, УФ-спектроскопия дает возможность дифференцировать
барбитураты в зависимости от типа замещения в пиримидиновом кольце на:
1. Двузамещенные (рН 2 - нет max, рН 10 - 240 нм, рН 13 -255-260 нм)
2. Трехзамещенные (рН 2 - нет max, рН 10 и рН 13 -245 нм)
3. Тиобарбитураты (рН 2 - 239 нм и 290 нм, рН 10 - 255 и 310 нм, рН 13 310нм).

73.

Спектр поглощения 5,5-дизамещенных
барбитуратов при различных значениях pH
Количественное определение:
I вариант – по разности
абсорбций в щелочном - рН 10 и
кислом - рН 2 растворах при
λ=240 нм.
II вариант – по разности
адсорбций в щелочных – рН 13 и
рН 10 растворах при λ=260 нм.

74.

Для количественного определения барбитуратов
используется спектрофотометрический метод.
При спектрофотометрическом определении
барбитуратов, выделенных из биологического
материала, используют принцип
дифференциальной спектрофотометрии, т.к.
прямому СФ-определению мешают посторонние
вещества, извлекающиеся из объекта
исследования совместно с барбитуратами.

75.

концентрацию барбитурата в растворе
(после его элюирования с пластинки)
определяют по разности абсорбции в
щелочном - рН 10 и кислом - рН 2
растворах при λ=240 нм.
DD=DрH10-DpH2

76.

Использование принципа
дифференциальной спектрофотометрии
возможно, когда поглощение примесей
при выбранной длине волны не зависит от
рН среды. Тогда при вычитании
оптических плотностей происходит
уничтожение абсорбции примесей, что
дает возможность получать истинные
результаты количественного определения.

77.

λ=240 нм DрН 2 = D2 б-та + D2 примесей,
ΔD = DрН 10 - DpH2 = (D10 б-та + D10 примесей) - D2 примесей,
D10 примесей = D2 nримесей
ΔD = D10 б-та
DpH 10 = D10 б-та + D10 примесей,

78.

Расчет концентрации ведут по уравнению закона БугераЛамберта-Бера:
%
DD E11cm
* L *C
%
C DD / E11cm
*L
откуда
, где
С - концентрация вещества в %;
DD - дифференциальная оптическая плотность (абсорбция);
1%
E1cm
- удельный показатель поглощения (численно равен поглощению
1% раствора при толщине слоя 1 см). Рассчитывается заранее для
каждого барбитурата по растворам с известной концентрацией.
L- толщина светопоглощающего слоя (1 см)

79. Токсикологическое значение барбитуратов

обусловлено, с одной стороны, их сильным
фармакологическим действием, а с другой стороны сравнительной доступностью для населения.
Опасность отравления усиливается способностью
барбитуратов к кумуляции.
В настоящее время известно о возможном пристрастии к
этой группе препаратов и о синергизме при совместном
приеме с алкоголем, опиатами и психотропными
средствами (транквилизаторами, алкалоидами
белладонны и др.), что усиливает токсикологическое
значение барбитуратов.

80.

«Психотропные вещества могут использоваться
в медицинских целях по назначению врача и в соответствии
с инструкциями по применению лекарственных средств,
которые доступны к свободному приобретению.
В частности, лекарственные препараты валокордин и
корвалол содержат психотропное вещество фенобарбитал
из группы барбитуратов», — пояснил истец.
Однако Верховный суд отклонил его иск.
«Законодательство в сфере дорожного движения запрещает
водителю управлять транспортным средством в состоянии
любого вида опьянения независимо от причины, вызвавшей
такое опьянение, которое, в частности, может явиться
следствием употребления разрешенных к применению
лекарственных препаратов», — указано в решении суда.

81. Токсичность

Смертельной дозой барбитуратов считают
одномоментный прием 10 разовых доз
каждого из препаратов или их смеси с
различными индивидуальными
различиями (фенобарбитал -2,0, этаминалNa -1,0). Иногда же эта доза достигает 4 и
даже 6-10 г (барбитал).

82. Токсикокинетика барбитуратов

Всасывание. Все барбитураты, являясь слабыми
кислотами (рКа=7,2-3,0), при физиологическом
значении рН легко всасываются в желудке и
тонком кишечнике способом пассивной
диффузии. Процесс значительно ускоряется в
присутствии этилового алкоголя.
Ослабление перистальтики кишечника в
глубоком коматозном состоянии может
задержать пребывание барбитуратов в желудке
до нескольких суток.

83. Распределение

Барбитураты распределяются по тканям и
биологическим жидкостям организма в
зависимости от нескольких факторов:
1. Степени ионизации молекул (при
физиологическом значении рН).
2. Жирорастворимости (липофильности)-Nзамещенные более липофильны.
3. Степени связывания с белками.
4. Интенсивности кровотока и др.

84. Метаболизм

В организме барбитураты могут
подвергаться ряду превращений.
Выделяются 4 основных типа
превращений:

85.

1. Окисление радикалов в 5-ом положении до образования спиртов,
кислот и кетонов (введение группы -ОН вместо Н в метиленовой
группе, присоединение -ОН к фенильному радикалу, окисление
конечной -СН3 группы до карбоксильной группы)
C2H5
C2H5
CH3
à)
CH3
C2H5
á)
HO
CH3
CH3
C2H5
OH

86.

2. Потеря радикала у атома N в случае 3-х
замещенных производных и превращение
их в дизамещенные производные:
а) деметилирование гексенала
O
O
H3C
H3C
NH
O
N
CH3
O
NH
- CH
3
O
N
H
O

87.

б) дебензоилирование бензонала и
бензобамила и превращение их в
фенобарбитал и кислотную форму
барбамила соответственно
O
N
C
NH +
COOH

88.

З. Десульфирование тиобарбитуратов
C=S
C=O
4. Гидролиз (распад пиримидинового
кольца)

89. Выделение

Наиболее устойчивым из барбитуратов является
барбитал, который на 65-85% выводится в
неизменённом (нативном) состоянии с мочой.
Барбамил, этаминал-Na, бутобарбитал почти
полностью разрушаются в печени и выводится
почками лишь в виде следов (10%). Гексенал и
тиопентал полностью разрушаются в печени (при
введении терапевтических доз) и выводятся в
виде метаболитов.

90. Токсикодинамика (развитие отравлений)

В клинической картине острых отравлений
барбитуратами и другими снотворными и седативными
средствами выделяют 4 ведущих клинических синдрома:
1.
Коматозное состояние и другие неврологические
расстройства (оглушённость, сон, отсутствие рефлексов).
2. Нарушение дыхания.
3. Нарушение функции сердечно-сосудистой системы.
4.
Трофические расстройства и нарушение функций
почек (соматогенная фаза отравления).

91.

Смерть при отравлении барбитуратами
наступает от паралича дыхательного и
сосудодвигательного центров.
При смертельных исходах после
отравления барбитуратами картина
вскрытия нехарактерна, поэтому химикотоксикологическое исследование объектов
приобретает решающее значение.

92. TIAFT reference blood level list of therapeutic and toxic substances (mg/L), (2004)

- Barbital (184.2) - Plasma - [5-30] - [20; L 90]
- Barbiturates:
- intermediate acting - Serum - [1-5] - [10-30; L >30]
- long acting - Serum - [10-40] - [40-60; L >80]
- short acting - Serum - [1-5] - [7-10; L >10-15]
- Phenobarbital (232.2) - Serum - [2-30(-40)] - [30-40;
L 45-120]
- Pentobarbital (226.3) - Plasma –
[1-10(25-40)] - [(5-)8-10; L (8-)15-25]

93.

Что собой представляет явление
таутомерии?

94.

Таутомерия (от греч. ταὐτός —
тот же самый и μέρος — часть) —
явление обратимой изомерии, при которой
два или более изомера (таутомера) легко
переходят друг в друга.
В результате устанавливается таутомерное
равновесие: вещество одновременно
содержит молекулы всех таутомеров в
определённом соотношении.

95. Благодарю за внимание!

96. Литература

1. М.Д. Швайкова. Токсикологическая химия. – М.:
Медицина., - 1975. – 376 с.
2. В.Ф. Крамаренко. Токсикологическая химия. – К.: Выща
шк., - 1989. – 447 с.
3. Об определении производных барбитуровой кислоты при
химико-токсикологических исследованиях. - Методические
указания. - 1974.