Изучение биосинтеза ферментов молокосвертывающего действия штаммами Irpex lacteus (Fr.) Fr. при разных условиях культивирования

1.

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФГБОУ ВПО «Донецкий государственный университет»
Биологический факультет
Кафедра физиологии растений
Направление подготовки 06.03.01 Биология
(Профиль: Биология)
Дипломная работа на тему:
«Изучение биосинтеза ферментов молокосвертывающего действия
штаммами Irpex lacteus (Fr.) Fr. при разных условиях
культивирования»
Выполнила: Грицай Елизавета Владиславовна
Научный руководитель:
Загнитко Юлия Петровна

2.

Цель работы: изучение молокосвертывающей активности штаммов гриба
Irpex lacteus Fr.
ЗАДАЧИ:
1. Исследовать зависимость продуцирования ферментов
молокосвертывающего действия штаммами I. lacteus Fr. в заданном
температурном режиме
2. Исследовать динамику казеиназной активности штаммов I. lacteus
в зависимости от температурного режима
3. Исследовать зависимость молокосвертывающей активности
штаммов I. lacteus от температуры и продолжительности прогревания
мицелия
4. Установить оптимальный температурный режим
кратковременного прогревания мицелия штаммов I. lacteus для
максимального накопления биомассы.
2

3.

Научная
новизна
работы.
Впервые
проведена
оптимизация
температурного режима культивирования для максимального выхода
протеиназ молокосвертывающего действия штаммами I. lacteus.
Практическая
значимость
работы.
Полученные
новые
экспериментальные данные можно использовать для дальнейшего
получения из культуральной жидкости исследуемых штаммов I. lacteus
ферментного препарата молокосвертывающего действия.
Объект исследования – штаммы сапротрофного дереворазрушающего
гриба Irpex lacteus Fr.
Предмет исследования – молокосвертывающая активность штаммов I.
lacteus.
3

4. История

4

5. Классификация ферментов

Фермент
Действие
оксидоредуктазы
окислительно-восстановительные ферменты
трансферазы
катализ перенесения разных групп с одной
молекулы на другую
гидролазы
катализ гидролитических реакций
лиазы
ферменты, которые отнимают от субстрата ту
или другую группу с образованием двойной
связи или, наоборот, присоединяют группу к
двойным связям
изомеразы
катализируют
соединений
лигазы
катализируют синтетические реакции которые
сопровождаются
отщеплениям
остатков
фосфорной кислоты от АТФ или аналогичного
трифосфата
5
изомеризацию
органических

6. Сферы применения

МЕДИЦИНА
ПРОИЗВОДСТВО ХЛЕБОБУЛОЧНЫХ
ИЗДЕЛИЙ
СЫРОВАРЕНИЕ
НАУЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
6

7. Материалы исследования

Irpex lacteus Fr.
7

8. Методы исследования

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА
Твердая питательная
среда (глюкозокартофельный агар)
1. Глюкоза – 10 г;
2. Картофель –250 г;
3. Агар–агар – 9 г.
(агароид – 25 г.);
4. Дистиллированная
вода – до 1 литра.
Среду разливать в
пробирки по 12 – 14 мл.
8
Жидкая глюкозо–
пептонная
питательная среда
1. Глюкоза - 10,0 г;
2. Пептон - 3,0 г;
3. CaCl2 – 0,05г;
4. KH2PO4 – 0,6г;
5. K2HPO4 – 0,4г;
6. MgSO4 * 7H2O – 0,5г;
7. ZnSO4 * 7H2O –
0,001г;
8. Дистиллированная
вода – до 1 литра.
Жидкая
модифицированная
глюкозо– пептонная
питательная среда
1. Глюкоза - 18,0 г;
2. Пептон - 8,0 г;
3. CaCl2 – 0,11г;
4. KH2PO4 – 0,6г;
5. K2HPO4 – 0,4г;
6. MgSO4 * 7H2O – 0,9г;
7. NaCl – 0,18г;
8. ZnSO4 * 7H2O –
0,001г;
9. Дистиллированная
вода – до 1 литра.

9. Методы исследования

9

10. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

450
1 час
3 часа
400
контроль
350
300
МСА, 250
ед/мл 200
150
100
50
0
5
10
15
20
возраст, сутки
25
30
Зависимость молокосвертывающей активности штамма D-1 I. lacteus
от длительности прогревания
10

11. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

700
1 час
3 часа
600
контроль
500
МСА,
ед/мл
400
300
200
100
0
5
10
15
20
возраст, сутки
25
30
Зависимость молокосвертывающей активности штамма D-2 I. lacteus
от длительности прогревания
11

12. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

300
1 час
3 часа
250
контроль
200
МСА,
150
ед/мл
100
50
0
5
10
15
20
возраст, сутки
25
30
Зависимость молокосвертывающей активности штамма D-8 I. lacteus
от длительности прогревания
12

13. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3500
1 час
3 часа
3000
контроль
2500
2000
МСА,
ед/мл
1500
1000
500
0
5
10
15
20
возраст, сутки
25
30
Зависимость молокосвертывающей активности штамма D-9 I. lacteus
от длительности прогревания
13

14. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3,5
1 час
3 часа
контроль
3
2,5
КА,
ед/мл
2
1,5
1
0,5
0
5
10
15
20
возраст, сутки
25
30
Зависимость казеиназной активности штамма D-1 I.
lacteus от длительности прогревания
14

15. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3,5
1 час
3 часа
контроль
3
2,5
КА,
ед/мл
2
1,5
1
0,5
0
5
10
15
20
возраст, сутки
25
30
Зависимость казеиназной активности штамма D-2 I.
lacteus от длительности прогревания
15

16. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3
1 час
3 часа
2,5
контроль
2
КА,
1,5
ед/мл
1
0,5
0
5
10
15
20
возраст, сутки
25
30
Зависимость казеиназной активности штамма D-8 I.
lacteus от длительности прогревания
16

17. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3,5
1 час
3 часа
контроль
3
2,5
КА,
ед/мл
2
1,5
1
0,5
0
5
10
15
20
25
30
возраст, сутки
Зависимость казеиназной активности штамма D-9 I.
lacteus от длительности прогревания
17

18. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

12000
D-1
D-2
D-8
D-9
МСА, ед/мл
10000
8000
6000
4000
2000
0
5
10
15
20
25
30
время культивирования, сутки
Зависимость МСА от температуры (t=28˚С) и времени культивирования
штаммов I. lacteus
18

19. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

30000
D-1
D-2
D-8
D-9
25000
МСА, ед/мл
20000
15000
10000
5000
0
5
10
15
20
25
30
время культивирования
Зависимость МСА от температуры (t=40˚С) и времени культивирования
штаммов I. lacteus
19

20. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

0,35
D-1
D-2
D-8
D-9
накопление биомассы, г
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
5
10
15
20
25
30
время культивирования, сутки
Накопление биомассы штаммами I. lacteus в зависимости от времени
культивирования
20

21. ВЫВОДЫ

21
Для повышения выхода в культуральную жидкость ферментов молокосвертывающего действия
мицелий штаммов Д-1, Д-8 и Д-9 следует прогревать перед снятием результатов начиная со
стационарной фазы роста, а мицелий штамма Д-2 – только в начале роста.
Для увеличения выхода ферментов казеиназного действия в культуральную жидкость целесообразно
прогревание исследуемых штаммов Д-1, Д-8 и Д-9 в начале роста и в фазе старения культур, а для
штамма Д-2 прогревание необходимо прогревание на протяжении всего роста. Между уровнем
протеолитической активности в зависимости от режима прогревания у исследованных штаммов не
отмечена корреляционная зависимость, что, вероятно, свидетельствует о принадлежности
исследуемых протеиназ к разным ферментным комплексам.
Повышение температуры до 40 С вызывает ингибирование синтеза ферментов
молокосвертывающего действия у всех исследованных штаммов, кроме штамма D-9 I. lacteus.
При кратковременном прогревании мицелия при температуре 40оС у штамма D-9 на 15 сутки
культивирования показаны максимальные показатели МСА по сравнению с контролем (28 оС).
Изменение уровня накопления биомассы исследуемыми штаммами I. lacteus на протяжении 30 суток
эксперимента соответствовало основным фазам роста грибов, что свидетельствует о том, что
подобранные условия являются оптимальными для роста исследуемых штаммов.