Lektsia__5

1. Регуляция внутриклеточных ферментативных реакций. Механизмы внутриклеточной ферментации.

2. ТИПЫ ПИТАНИЯ МИКРОРГАНИЗМОВ

• АВТОТРОФНЫЙ – использование в качестве
источников питания простейших компонентов: воды,
углекислого газа (как единственного источника
углерода) и минеральных солей;
• АВТОТРОФЫ – микроорганизмы, получающие весь
углерод за счет фиксации СО2 .
• Варианты автотрофного питания:
• фотоавтотрофы – используют свет как источник
энергии для расщепления СО2;
хемоавтотрофы – используют химический источник
энергии для вовлечения СО2 в обмен веществ (энергия
окислительно-восстановительных реакций: окисление
восстановленных неорганических соединений - NH3, NO2-,
H2, восстановленные формы серы (H2S, S0, S2O32-),
соединения Fe2+)
2

3. ТИПЫ ПИТАНИЯ МИКРОРГАНИЗМОВ

• ГЕТЕРОТРОФНЫЙ – использование в качестве
источников питания более сложных источников
углерода - органических соединений;
• ГЕТЕРОТРОФЫ – микроорганизмы, источником
углерода для которых являются простые органические
соединения.
• Варианты гетеротрофного питания:
фотогетеротрофы используют свет как источник
энергии и органическое вещество как основной
источник углерода (зеленые и пурпурные бактерии);
хемогетеротрофы используют химический источник
энергии и органическое вещество как источник углерода
(подавляющее большинство бактерий).
Организмы, удовлетворяющие все свои потребности в
углероде за счет основного источника, относят к
прототрофам.
3

4. ТИПЫ ПИТАНИЯ МИКРОРГАНИЗМОВ

Классификация микроорганизмов по природе
используемых доноров электронов
ЛИТОТРОФНЫЙ
Неорганические доноры
электронов (Н2, NH3, H2S, Fe+2,
CO и др.)
ОРГАНОТРОФНЫЙ
Доноры электронов органические соединения
4

5. ТИПЫ ПИТАНИЯ МИКРОРГАНИЗМОВ

• Важным классификационным признаком для
микроорганизмов по типу питания является отношение
к использованию молекулярного кислорода.
• Организмы, не способные расти в отсутствие кислорода,
называют аэробами, способные к бескислородному
существованию – анаэробами.
• Облигатные аэробы (анаэробы) растут только в
присутствии (отсутствии) кислорода.
• Факультативные аэробы (анаэробы) могут расти как в
тех, так и в других условиях.
• Микроаэрофилы - облигатные аэробы,
предпочитающие более низкие парциальные давления
кислорода, чем в воздухе (например, микроорганизмы,
получающие энергию путем окисления молекулярного
водорода: гидрогеназа – фермент, катализирующий эту
реакцию, инактивируется кислородом)
5

6. ПИТАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ основные функции элементов

Элемент
Физиологическая роль
H
О
Входит в состав воды и органического вещества
С
N
Входит в состав органического вещества
S
P
Входит в состав белков и некоторых коферментов
K
Один из главных неорганических катионов клетки,
кофактор некоторых ферментов
Входит в состав воды и органического вещества;
служит акцептором электронов при дыхании
Входит в состав белков, нуклеиновых кислот,
коферментов
Входит в состав нуклеиновых кислот, осолипидов,
коферментов
6

7. ПИТАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ основные функции элементов

Элемент
Физиологическая роль
Mg
Важный катион клетки; неорганический кофактор
многих ферментов; входит в состав хлорофиллов
Mn
Неорганический кофактор многих ферментов,
иногда заменяет Mg
Сa
Важный катион клетки, кофактор некоторых
ферментов
Fe
Входит в состав окислительных систем (цитохромов
и других белков, содержащих или не содержащих
гем); кофактор некоторых ферментов
Co
Cu, Zn,
Mo
Входит в состав витамина В12 и его производных
Неорганические компоненты некоторых
ферментов; Mo – кофактор нитрогеназ, гидрогеназ
7

8. Принципы регуляции метаболизма

КАТАБОЛИЗМ - расщепление питательных
веществ, поступающих из окружающей среды преимущественно за счет реакций окисления;
сопровождается освобождением энергии,
заключенной в молекулах сложных органических
соединений, и накоплением ее в форме энергии
макроэргических пирофосфатных связей АТФ;
АНАБОЛИЗМ - биосинтез сложных веществ из
простых продуктов катаболических реакций;
образование сложных молекул из простых связано с
уменьшением энтропии в системе, и, следовательно,
с потреблением энергии, заключенной в
макроэргических связях.
8

9. Принципы регуляции метаболизма

•Микроорганизмы обладают более мощным метаболическим
потенциалом по сравнению с высшими организмами.
•Микробная клетка обладает всем необходимым для развития и
роста популяциии способна использовать большое разнообразие
веществ как источников энергии и углерода. Наиболее
разнообразен метаболизм у бактерий:
•Только бактерии – литотрофы способны к извлечению энергии из
восстановленных неорганических веществ – Fe, S, H2S, H2, NH3,
NO2-, CO и др.
•Бактерии могут использовать органические соединения – от С1 до
полимеров – в качестве источников углерода. Только бактерии
способны утилизировать метан.
•Бактерии, как и растения, способны к автотрофному питанию –
использованию СО2 как единственного источника углерода,
однако у бактерий найдено по меньшей мере три различных
механизма усвоения СО2 против единственного у растений.
9

10. Принципы регуляции метаболизма

•В связи с большим разнообразием условий
обитания микроорганизмов у них
сформировались различные типы метаболизма,
существенно отличающиеся от метаболизма
эукариотов.
•Производство энергии всегда сводится к
производству макроэргических связей АТФ.
Энергия при этом поставляется либо в процессе
дыхания, либо в процессе брожения. Это
основные процессы энергопроизводства, хотя
существуют и другие.
10

11. Принципы регуляции метаболизма

•Дыхание - метаболический процесс с
образованием АТФ, включающий окислительновосстановительные реакции с участием в качестве
доноров электронов либо органических, либо
неорганических веществ.
• Дыхание может протекать с участием
молекулярного кислорода в качестве
терминального акцептора электронов – аэробное
дыхание;
•У некоторых бактерий терминальным
акцептором электронов являются сульфаты,
нитраты, карбонаты. В этих случаях говорят об
анаэробном дыхании.
11

12. Принципы регуляции метаболизма

•Брожение – метаболический процесс, при
котором как донорами, так и акцепторами
электронов являются органические соединения.
В процессе брожения происходит строго
сбалансированное перераспределение электронов
между органическими соединениями без отвода
электронов во внешнюю среду. Этот строгий
баланс есть главное отличие между дыхательным
и бродильным типами метаболизма.
•Помимо дыхательного и бродильного типов
метаболизма существуют и другие
12

13. ОСНОВНЫЕ ТИПЫ МЕТАБОЛИЗМА

ТИП ПИТАНИЯ
ТИП
МЕТАБОЛИЗМА
ИСТОЧНИК
ЭНЕРГИИ
ИСТОЧНИК
УГЛЕРОДА
ДЫХАТЕЛЬНЫЙ
Органическое
вещество
Неорганическое
вещество
Органическое
вещество,
СО2
Органическое
вещество
Органическое
вещество
МЕТАНОГЕННЫЙ
Органическое
вещество,
Неорганическое
вещество, Н2
Органическое
вещество,
СО2
Органотрофы,
автотрофы
ФОТОТРОФНЫЙ
Солнечная
радиация
Органическое
вещество,
СО2
Фотоорганотрофы,
Фотоавтотрофы
БРОДИЛЬНЫЙ
Органотрофы,
автотрофы
Хемоорганотрофы
13
МЕТАНОГЕНЕЗ ВСТРЕЧАЕТСЯ ТОЛЬКО У МИКРООРГАНИЗМОВ

14. Классификация бактериальных ферментов

• Экзоферменты
Синтезируются во внешнюю среду
• Эндоферменты
Локализация:
– Периплазматическое пространство
– ЦПМ
– Цитоплазма

15. Классификация бактериальных ферментов

• Конститутивные
Синтезируются постоянно (в том числе и при отсутствии
субстрата)
• Индуцибельные
Синтезируются только при наличии субстрата
Например: пенициллиназа – синтезируется только при наличии
пенициллина

16. Индукция и репрессия синтеза ферментов.

• Индукция фермента – резкое
увеличение скорости его синтеза в
ответ на появление индуктора.
Явление индукции ферментов впервые
было изучено лауреатами Нобелевской
премии Ф.Жакобом и Ж.Моно в 1906-х гг.
16

17. Индукция и репрессия синтеза ферментов.

Согласно этой модели, на хромосоме
имеется по крайней мере четыре
компонента системы регуляции:
структурный ген (или гены,
контролирующие связанные между собой
биохимические функции), ген-регулятор,
оператор и промотор, которые
составляют оперон. Ген-регулятор (R),
определяет структуру белка-репрессора.
17

18. Индукция и репрессия синтеза ферментов.

Этот белок способен связываться с оператором,
который контролирует функционирование
расположенных рядом структурных генов. Промотор
является начальным участком для связывания РНКполимеразы, представляющей фермент, который
катализирует транскрипцию ДНК в мРНК. Если белокрепрессор связан с оператором, то РНК-полимераза не
имеет возможности перемещаться (или
присоединяться) к промотору и в этом случае мРНК,
которые комплементарны последовательности генов,
не образуются. Следовательно, и соответствующие
ферменты также не синтезируются. Происходит
репрессия синтеза белка
18

19. Индукция и репрессия синтеза ферментов.

В другом случае, когда оператор свободен от
белка-репрессора, РНК-полимераза,
присоединившись к промотору, может
перемещаться и транскрибировать гены.
Индукция синтеза белка. Образование
индуцибельных ферментов происходит при
добавлении индуктора, который связывается с
белком- репрессором и инактивирует его.
19

20. Индукция и репрессия синтеза ферментов.

Жакоб и Моно считали, что репрессор
представляет собой аллостерический белок,
который содержит два специфических центра.
Один центр обладает сродством к
нуклеотидной последовательности оператора,
а другой центр обладает сродством к молекуле
индуктора.
Присоединение индуктора к репрессору ведет к
снижению сродства первого аллостерического
центра к оператору, в результате оператор
освобождается от репрессора.
20

21. Индукция и репрессия синтеза ферментов.

Аллостерический центр (от греческого
«аллос»-другой, «стереос» пространственный)– это участок
фермента, который образует комплекс с
конечным продуктом, в результате чего
искажается трехмерная структура
фермента (в том числе и его активного
центра) и фермент становится не
способным катализировать реакцию.
21

22. Индукция и репрессия синтеза ферментов.

Аллостерические ферменты представляют собой
олигомеры, состоящие из двух, четырех, шести (или
более) идентичных или различных субъединиц,
способных взаимодействовать друг с другом.
Связывание ингибитора искажает трехмерную
структуру фермента. Это искажение передается
активному центру и вызывает подавление активности
фермента. Таким образом, некоторые метаболиты
обладают способностью передавать информацию (как
правило, путем изменения концентрации) ключевым
ферментам о состоянии обмена веществ в клетке, в
частности, подавать сигнал о необходимости
прекращения дальнейшего функционирования данного
метаболического пути.
22

23. Ретроингибирование и преодоление этого явления.

Наиболее гибким и широко распространенным способом контроля метаболизма в клетке является регуляция активности фермента по принципу обратной связи.
Известно, что процессы биосинтеза многих
незаменимых (первичных метаболитов)
характеризуются тем, что конечный продукт данного
(конкретного) биосинтетического пути при повышении
его концентрации подавляет активность первого
фермента этого пути. В результате такого подавления и
соответствующий процесс биосинтеза
останавливается. Этот механизм автоматической
регуляции называют подавлением под действием
конечного продукта или ретроингибированием .
23

24. Ретроингибирование и преодоление этого явления.

• В процессе роста бактерий для
подавление активности первого
фермента, преимущественно
используют добавление аминокислот,
пуринов, пиримидинов, так как эти
соединения оказывают ингибирующее
действие на свой собственный синтез
из молекул предшественников.
24

25. Ретроингибирование и преодоление этого явления.

Борьба с ретроингибированием
1. Создание мутантных штаммов, которых
фермент бы не имел аллостерического центра.
2. Удаление накапливающегося целевого
продукта: ферментацию в этом случае
осуществляют с сорбентом (активированным
углем), на котором триптофан сорбируется.
3. Действие на аллостерический центр
специальных активатором – аллостерических
эффекторов, которые более активно
связываются с аллостерическим центром, чем
25
ингибитор (триптофан).

26. Строгий аминокислотный контроль метаболизма микроорганизмов и его значение при получении лекарственных средств.

Строгий АК контроль метаболизма клеток
позволяет ей быстро
приспосабливаться к меняющимся
условиям: или выживать, или быстро
размножаться.
Строгий АК контроль осуществляется с
участием рибосом и
многофункционального биорегулятора
гуанозин-трифосфата.
26

27. Строгий аминокислотный контроль метаболизма микроорганизмов и его значение при получении лекарственных средств.

Гуанозин-трифосфат выполняет
принципиальную роль при переключении
метаболизма клетки.
Если перевести клетки с бедной среды на
богатую, они начинают быстро размножаться,
при этом резко повышается скорость
образования РНК, образуется много рибосом и
повышается синтез белка. В случае переведения клеток с богатой среды на бедную скорость
белка снижается. Это изменение скорости
синтеза белка происходит благодаря строгому
аминокислотному контролю синтеза РНК.
27

28. Строгий аминокислотный контроль метаболизма микроорганизмов и его значение при получении лекарственных средств.

Ключевую роль в механизме строгого
аминокислотного контроля синтеза РНК играет
ген rel А. Важно знать, что от механизма
строгого аминокислотного контроля во многом
зависит успех ферментации, биосинтез
целевых продуктов.
Stringent control – строгий контроль синтеза
РНК имеет место у rel А положительных клеток
«+», то есть у клеток, имеющих ген rel А
28

29. Регуляция усвоения азотсодержащих соединений.

Все микроорганизмы хорошо усваивают азот
из солей аммония, органических азотсодержащих соединений это и атмосферный азот и
такие сложные органические молекулы, как
гистидин, пролин, аргинин.
Конечным продуктом катаболизма азотсодержащих соединений является аммиак. В
свою очередь, аммиак необходим для синтеза
аминокислот. Ключевыми соединениями в
биосинтезе азотсодержащих веществ
являются глутамин, глутамат,аспартат.

30. Регуляция усвоения азотсодержащих соединений.

Глутамин, глутамат и аспартат могут
превращаться друг в друга в
результате следующих реакций:
1. Глутамат + NH3 + АТФ → глутамин +
АДФ + Ф
2. Глутамин + α-кетоглутарат +
НАДФН → 2 глутамат + НАДФ+
3. Глутамат + оксалоацетат ↔
аспартат + α-кетоглутарат
30

31. Регуляция усвоения азотсодержащих соединений.

1) Ферменты, катализирующие эти реакции
обнаружены у всех микроорганизмов,
способных усваивать аммиак в качестве
единственного источника азота.
2) Первую реакцию катализирует фермент
глутаматсинтетаза, состоящая из 12
субъединиц (молекулярная масса 600000)
3) Ингибиторами глутаматсинтетазы
является АМФ. 12 молекул АМФ садятся на
12 субъединиц глутаматсинтетазы и
ингибируют ее, при этом прекращается
31
синтез целого ряда азотистых продуктов.

32. Регуляция усвоения азотсодержащих соединений.

Так как синтез некоторых ферментов
(например, протеиназ), а также многих
вторичных метаболитов подвержен азотной
репрессии, то продукция этих соединений
может быть увеличена не только в результате замены катиона аммония в среде на менее
эффективные источники азота, но и с
помощью специфических мутаций, снимающих
репрессию аммиаком. Кроме того, регуляция
соответствующих генов может быть
изменена с помощью методов генной
32
инженерии.

33. Катаболическая репрессия в создании и производстве лекарственных средств.

В природных условиях в среде может находиться одновременно несколько субстратов,
которые микробная клетка способна усваивать
в качестве источников углерода и энергии.
Однако это не приводит к синтезу всех ферментов, необходимых для катаболизма. В первую
очередь образуются те ферменты, которые
обеспечивают утилизацию наилучшего
субстрата для поддержания наиболее высокой
скорости роста. Для многих микроорганизмов
таким субстратом является глюкоза.
33

34. Катаболическая репрессия в создании и производстве лекарственных средств.

Таким образом глюкоза может влиять на
утилизацию других субстратов, вызывая у
микроорганизмов катаболитную репрессию.
Глюкоза относится к легко усвояемым или
быстро ассимилируемым субстратам, которые
вызывают постоянную более или менее
выраженную репрессию катаболитических
ферментов. В результате подавляется
окисление других субстратов.
34

35. Катаболическая репрессия в создании и производстве лекарственных средств.

Катаболиты глюкозы (АТФ) накапливаются внутри клетки и подавляют синтез
катаболитических ферментов. Помимо
репрессии имеет место и процесс ретроингибирования – подавление
активности ключевого фермента по
принципу обратной связи – АТФ подавляет активность фермента гликолиза
фосфофруктолазы, связываясь с ее
аллостерическим центром.
35

36. Катаболическая репрессия в создании и производстве лекарственных средств.

• Для биотехнолога важно иметь такие
мутанты, у которых не было бы
процесса катаболитной репрессии,
например, она может неблагоприятно
отразиться на синтезе антибиотиков.
36

37. Молекулярные механизмы защиты продуцентов от веществ с «суицидным эффектом».

Биотехнологам приходится сталкиваться с
проблемой защиты продуцента от
вырабатываемого в большом количестве
целевого продукта. Особенно наглядно это
демонстрируется при создании
суперпродуцентов синтезирующих
антибиотики. Механизмы защиты продуцента
от собственных потенциально
«суицидальных веществ» могут быть
разными.
37

38.

1) Особенность синтеза молекул АК
(точнее сборка углеродного
скелета).Синтез происходит особенно
интенсивно и достигает максимума,
когда культура продуцента замедляет
скорость размножения своих клеток, т.е.
накопившийся АБ не способен
причинить вред своим клеткам, в
которых синтез белка уже почти
прекратился.
38

39.

2) В процессе или после сборки молекулы
АБ подвергается временной обратимой
инактивации. Инактивация поисходит за
ччет фосфорилирования одной из
многочисленных в аминогликозидной
структуре амино- или гидроксильных
групп.
39

40.

3) Защита обусловлена наличием в к-ке
специфической метилазы, метилирующей определенный адениловый
остаток в 23 S рибосомальной РНК. В
результате 50 S субъединица рибосомы
продуцента имеет конфигурацию, при
которой реагирование АБ с
пептидилтрансферазным центром
рибосомы невозможна.
40

41.

4) Место биосинтеза АБ изолированно от
чувствительных к нему метаболическиз
реакций продуцента («компартментация»).
Молекула АБ собирается в мультиферментных
комплексах, обеспечивающих упорядоченную
последовательность реакций сборки.
Взаиморасположение ферментов в комплексе
координируется за счет дисульфидных и
водородных связей. Мультиферментные
комплексы локализуются на периферии клетки
продуцента.
41