Онкогенетика и пути сигнальной трансдукции. Лекция 1

1.

Онкогенетика и пути сигнальной трансдукции
Лекция 1
Сигнал
Получение
сигнала
Интеграция Амплификация Мишень
Адаптация
Основные компоненты пути передачи сигнала
1

2.

Введение в онкогенетику
Свойства раковых клеток.
Факторы, влияющие на онкогенез.
Онкогены, протоонкогены и анти-онкогены.
Онкогенные вирусы.
ДНК-содержащие вирусы.
Ретровирусы.
2

3.

Свойства, отличающие раковую клетку от нормальной
Первичные клетки
Кризис
Иммортализация
Установление клеточной линии
Метастаз
Полностью
онкогенные клетки
Трансформация
Трансформированные клетки
3

4.

Свойства, отличающие раковую клетку от нормальной
Первичные клетки
Рост клеток ограничен
свойствами индивидуальной ткани
Полностью онкогенные клетки
становятся мобильными
и могут мигрировать, образуя
новые колонии
Опухоли в новых местах
Клеточная линия
Делится неограниченно,
но клетки продолжают
прилипать к субстрату,
требуют сыворотки, и
ингибируются контактом
(контактное ингибирование)
Трансформированные клетки
Трансформированные клетки
могут образовывать опухоль
независимы от прикрепления,
сыворотки, ингибирования контактом;
изменяют форму,
округляются и растут очагом (into focus)
4

5.

Метастазы (metastasis)
Злокачественные опухоли обычно
дают метастазы, что затрудняет
лечение. Рисунок показывает
типичные места метастаз при раке
простаты.
5

6.

Метастазы
МЕТАСТАЗ
Первичная опухоль
Инвазия опухолевой
клетки в стенку капилляра
Кровеносная
(лимфатическая)
система
Опухолевая клетка
в новом месте
Инвазия опухолевой
клетки в новый капилляр
Метастазирующая опухоль
6

7.

Этапы образования метастаз
Опухоль эпителия
1. Проникновение в другую ткань
2. Инвазия капилляра
Соединительная ткань
капилляр
3. Прикрепление к стенке
капилляра в печени
Перенос с кровью
(1 из 1000 кл выживет
и даст метастазы)
4. Проникновение
в ткань печени
5. Пролиферация,
образование
метастаза в печени
7

8.

Отсутствие контактного ингибирования у
раковых клеток
Контактное ингибирование.
Монослой клеток дикого
типа
Отсутствие контактного
Ингибирования.
Мультислой раковых клеток
8

9.

Клетки, трансформированные вирусом саркомы Рауса
(Rous sarcoma virus)
(B) При непермиссивной
(A) Клетки имеют аномальную форму
при пермиссивной температуре (34°C), температуре (39°C) клетки
приобретают нормальную форму.
при которой продукт гена v-src (ts)
функционален.
9

10.

Диаметр опухоли (мм)
Рост типичной опухоли человека (рак груди)
Смерть
(1012 кл)
Пальпиро
вание
(109 кл)
Рентген
(108 кл)
Число удвоений клеток опухоли
Диаметр опухоли (в логарифмическом масштабе).
Могут пройти годы, пока опухоль станет заметной.
10

11.

В основе рака лежат генетические изменения.
Доказательства:
1. «Клональность» опухолей - все
клетки опухоли несут одинаковые
изменения в ДНК
Транслокация между
хромосомами 9 и 22
в случае лейкемии
(chronic myelogenous leukemia).
Образование «филадельфийской
хромосомы»
11

12.

Доказательства «клональности» опухолей
Транслокация между
хромосомами 9 и 22
в случае лейкемии
(chronic myelogenous leukemia).
Образование «филадельфийской
хромосомы»
12

13.

Образование «филадельфийской хромосомы»
(слияние генов BCR/ABL в результате транслокации)
FISH (fluorescence in-situ hybridisation)
ABL(красный) – 9 хромосома
BCR (зеленый) – 22 хромосома
13

14.

Доказательства моноклонального
происхождения раковой опухоли
1. Все клетки опухоли несут
одинаковые изменения в ДНК
Красные и серые клетки в нормальной ткани – клетки, у которых
инактивированы разные Х хромосомы. При изучении клеток опухоли было
показано, что все они, как правило, содержат одну и ту же
инактивированную Х хромосому.
14

15.

2. Корреляция между частотой мутагенеза и
канцерогенеза для ряда агентов
Частота обнаружения рака мочевого пузыря в зависимости
от времени работы с канцерогеном (2-naph-thylamine).
15

16.

3. Для возникновения раковой опухоли
недостаточно одной мутации
Возникновение опухолей толстой кишки
у женщин Англии в зависимости от возраста
(C. Muir et al., Cancer Incidence in Five Continents, Vol. V.
Lyon: International Agency for Research on Cancer, 1987.)
Минимальное число событий - 6
16

17.

3. Для возникновения раковой опухоли
недостаточно одной мутации
Возникновение различных типов рака
значительно увеличивается с возрастом
17

18.

Ожидаемая смертность от рака в США, 2018
Новые случаи
за год
Смертность за год
Ротовая полость
51 540
10 030
Органы пищеварения
319 160
160 820
Дыхательная система
253 290
158 770
Меланомы
91 270
9 320
Репродуктивные органы
286 390
62 330
Рак груди
268 770
41 400
Мочевыделительная система
150 350
33 170
Лейкемии и лимфомы
143 480
45 200
ЦНС и глаза (глиомы, ретинобластомы и
т.д.)
27 320
18 180
56 430
3 080
1 735 050
609 640
Тип опухоли
Эндокринная система
Всего
18

19.

Смертность от рака в 2008 (ВОЗ)
Тип опухоли
Смертность за год
Рак легких
1.4 млн
Рак желудка
740 000
Рак печени
700 000
Рак толстой кишки
610 000
Рак молочной железы
460 000
Смертность 2008
Другие
53%
Легкие
23%
Кишечник
10%
Грудь
8%
Простата
6%
70% - в странах с низким и средним уровнем дохода.
2030 ~ 11 млн
19

20.

Выживаемость
Зависимость от: типа рака
пола
возраста
социального статуса
5-годичная выживаемость:
Опухоли поджелудочной железы, легких, пищевода и желудка (2-15%)
Рак толстой кишки (колоректальный) (около 50%),
Рак мочевого пузыря, шейки матки и простаты (53-71%)
Рак груди (80%)
20

21.

Влияние факторов окружающей среды
1. Курение
Китай
Рак печени 11%
20-летний лаг-период между
курением и раком легких
Кол-во
выкуренных
сигарет
(на
человека
в год)
Смерть
от рака
легких
(на 100
тыс)
США
Болезни
сердца
36%
21

22.

Оценка возникновения рака легких (на 100 000) в 2012 г
Венгрия
Стареющая популяция, в прошлом
многие венгры курили. Хотя согласно
данным 2009 г 33% мужчин и 23%
женщин курят, должно пройти
несколько лет, чтобы частота рака
легких уменьшилась
США
Программы борьбы с
табаком привели к
уменьшению курения
и постепенному
уменьшению
заболеваемости
Мексика
Как и во многих других
развивающихся странах,
низкий уровень
потребления табака
коррелирует с низкой
частотой рака легких
Центральная Африка
Низкая частота рака
легких, но службы
общественного
здравоохранения
предсказывают ее рост
из-за активной рекламы
табака
Китай
Больше
половины
мужчин курит, и
уровень
заболеваемости
раком легких
растет
22

23.

Для Тайваня характерен низкий уровень курения, но
частота возникновения рака легких является высокой
Частота возникновения рака легких
В мире – 16%
Доля курильщиков
В мире – 22%
23

24.

Основные типы опухолей легких на Тайване
Существует множество
факторов, вызывающих
аденокарциному легких.
Не связана с курением.
Основная причина
плоскоклеточного и
мелкоклеточного рака
легких - курение
Аденокарцинома
Плоскоклеточный рак
Мелкоклеточный рак
Другие
24

25.

Влияние факторов окружающей среды
2. Питание и увеличенный вес
3. Репродуктивные и гормональные факторы
4. Вирусы, бактерии и паразиты:
Helicobacter pylori
Вирусы папилломы (human papillomaviruses (HPVs)
Epstein–Barr virus (EBV)
5. Факторы окружающей среды (солнце…)
Смерти от злокачественных мезотелиом, 1968-2006
Асбест (Европа, 1950-1970)
25

26.

Запрет на использование асбеста
The Jussieu Campus of the Universite Pierre et Marie Curie (UPMC) in Paris
26

27.

Различия между странами по частоте возникновения
различных типов рака
Локализация
опухоли
Популяция с высокой частотой
Популяция с низкой частотой
Локализация
Встречаемость
Локализация
Встречаем
ость
Легкие
США (New Orleans, blacks)
110
Индия (Madras)
5.8
Грудь (f)
Гавайи (Hawaiians)
94
Израиль (non-Jews)
14.0
Простата
США (Atlanta, blacks)
91
Китай (Tianjin)
1.3
Желудок
Япония (Nagasaki)
82
Кувейт (Kuwaitis)
3.7
Печень
Китай (Shanghai)
34
Канада (Nova Scotia)
0.7
Меланома
Австралия (Queensland)
31
Япония (Osaka)
0.2
М.пузырь
Швейцария (Basel)
28
Индия (Nagpur)
1.7
Пр.кишка
Израиль (European and USA born)
23
Кувейт (Kuwaitis)
3.0
Подж.железа
США (Los Angeles, Koreans)
16
Индия (Poona)
1.5
Губа
Канада (Newfoundland)
15
Япония (Osaka)
0.1
Лейкемия
Канада (Ontario)
12
Индия (Nagpur)
2.2
Встречаемость = число новых случаев в год на 100,000 человек
27

28.

Выравнивание частот в локальной популяции
Простата
Осака 1970-71
Осака 1988-92
Кишечник
Желудок
Японские мигранты на Гавайях
1988-92
Грудь
Гавайи (белые) 1968-72
Гавайи (белые) 1988-92
28

29.

Генетический контроль
Два типа генов, мутации в которых вызывают
трансформацию:
Онкогены - гены, вызывающие трансформацию клеток-хозяев (~100).
прото-онкогены
Анти-онкогены (tumor supressors) (~10)
- делеции этих генов (или инактивирующие их мутации) онкогенны.
29

30.

Изменения могут включать:
1. Конститутивную активацию функции, которая обычно
регулируется.
2. Экспрессию гена в тех клетках, где он обычно не
экспрессируется.
3. Оверэкспрессию в его обычной ткани.
4. Изменения в продукте гена.
5. Нормальные клетки могут быть превращены в раковые с
помощью прямого введения экзогенной генетической
информации. Эта экзогенная генетическая информация может
быть введена экспериментально с помощью трансфекции ДНК или
благодаря онкогенным вирусам (первые работы – начало 70-х).
30

31.

ДНК-вирусы, ассоциированные с опухолями человека
Вирус
Связанные с ним
опухоли
Другие факторы
риска
(предполагаемые)
Районы с высокой
заболеваемостью
Papovavirus family I
Вирус папилломы
(разнообразные штаммы)
Бородавки
(доброкачественные)
Повсюду
-
Рак шейки матки
Повсюду
Курение
Рак печени
Юго-Восточная
Азия, Тропическая
Африка
Афлатоксин
(при заражении
пищи грибками),
алкоголизм, курение,
другие вирусы
Лимфома Беркитта
Западная Африка,
Папуа-Новая Гвинея
Малярия
Носоглоточный рак
Южный Китай,
Гренландия
(инуиты)
Тип гистонесовместимости (?),
питание соленой
рыбой в детств3е1(?)
Hepadnavirus family
Вирус гепатита В
Herpesvirus family
Вирус Эпштейна-Барр

32.

Геном SV40 (5,2 kb)
32

33.

Геном аденовируса (36 kb)
(обведены гены, которые могут быть удалены
при создании векторов)
33

34.

Продуктивная инфекция
в пермиссивных клетках
Трансформация
непермиссивных клеток
Ранняя инфекция
Вход и образование
компонентов вируса
Абортивная инфекция
Вход вируса
Поздняя инфекция
Интеграция
Репликация и сборка
Вирусная ДНК
становится частью
хозяйского генома
Лизис
Смерть клетки
и выход вирусов
Трансформация
Клетка изменяет
форму и растет
Литический цикл
Лизогения
Жизненный цикл вируса
34

35.

Бактерия
Бактериофаг λ
Адсорбция и инъекция ДНК
Интеграция
Индукция
Деления клеток
Лизогения
Литический цикл
Жизненный цикл бактериофага λ
35

36.

Онкогенные вирусы
Латентный жизненный цикл
Вирус
Клетка
Интеграция
Трансформация
Синтез вирусоспецифичных белков – зрелых вирусов нет
Изменение свойств клетки-хозяина - ТРАНСФОРМАЦИЯ
Жизненный цикл вируса при инфекции непермиссивных клеток 36

37.

Поздние гены
SV40
Ранние гены
Поздние гены
--------------------~-~-~-~-~-~-~-~-~-~аденовирус
Ранние гены
Инфекция
Интеграция
Хозяйская ДНК
~~~~~~~~~~~~~---------------~~~~~~~~~~~~~~
Белки:
Т-антиген (SV40)
E1A, E1B (аденовирус)
Экспрессия вирусных белков при трансформации
37

38.

Возможный механизм возникновения рака шейки матки
при инфекции вирусом папилломы
Белки вируса
(контроль репликации)
Хромосома
Случайная интеграция
фрагмента вирусной ДНК
в хромосому
ДНК вируса
Доброкачественная опухоль
или бородавка
Белки вируса
(неконтролируемая
репликация)
Ген вируса
(белок репликации
вируса)
Злокачественная опухоль
38

39.

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2008
“for discovering the human papilloma viruses"
Harald zur Hausen
1/2 of the prize
USA
German Cancer
Research Centre,
Heidelberg, Germany
b. 1936
39

40.

Свойства основных классов трансформирующих вирусов
Генетический
материал
вируса
Размер генома
Онкогены
Происхождение
онкогена
Полиомы
(Polyoma:
SV40)
ДНК
5-8 kb
T- антигены
Ранний вирусный
ген
Папилломы
HPV (human
papilloma virus)
ДНК
~8 kb
E6 и E7
Ранний вирусный
ген
Аденовирус
ДНК
~37 kb
E1A и E1B
Ранний вирусный
ген
Герпес
( Epstein-Barr)
ДНК
~160 kb
BNLF-1
Латентный
вирусный ген
Ретровирус
(трансформиру
ющий)
РНК
6-9 kb
Различные
гены клетки
Клеточный ген
Типы вирусов
40

41.

РНК-вирусы, ассоциированные с опухолями человека
Другие факторы
риска
(предполагаемые)
Связанные с ним
опухоли
Районы с высокой
заболеваемостью
Вирус Т-лейкоза человека
типа I (HTLV-I)
Т-клеточный лейкоз/
лимфома у взрослых
Япония (Кюсю),
Вест-Индия
-
Вирус иммунодефицита
человека (вирус СПИДа,
HIV-I)
Саркома Капоши
(рак эпителия
кровеносных
сосудов?)
Центральная
Африка
Иммунная
недостаточность,
заражение другим
вирусом (?)
Вирус
Семейство ретровирусов
Ретровирусы
способные к репликации
способные к трансформации
неспособные к репликации
способные к репликации
41

42.

Жизненный цикл ретровируса
Транскрипция
------------------ РНК
~~~~------------------~~~~~
~~~~------------------~~~~~
хозяйская ДНК
Интеграция
------------------ вирусная ДНК
-----------------Pol
------------------
Трансляция:
вирусные белки,
в т.ч. Pol, Env
вирусная РНК
Сборка и
освобождение вируса
42

43.

Строение генома ретровируса
GAG (g-группоспецифичный, ag – антиген) -> внутренняя структура вириона
POL – обратная транскриптаза и интеграза
ENV – наружная оболочка вириона
PBS (primer binding site)
PPT (polypurine tract)
43

44.

Сравнение геномов неонкогенного и онкогенного ретровирусов
Вирус лейкемии мышей
Вирус саркомы Рауса
src
v-src
v-src не содержит интронов
44

45.

Большинство трансформирующих вирусов –
репликативно-дефектны
Вирус саркомы Рауса
(недефектный, трансформирующий)
Вирус лейкемии Абельсона
(дефектный)
Вирус саркомы Harvey
(дефектный)
Последовательности ретровируса
крысы VL30
src, abl и ras – последовательности v-onc,
захваченные вирусом
45

46.

Онкогены, присутствующие в ретровирусах
Rous sarcoma virus (RSV)
Francis Peyton Rous
1879-1970
USA
1/2 Нобелевской премии по физиологии
и медицине 1966
46

47.

Ретровирусы
способные к трансформации
способные к репликации
неспособные к репликации
способные к репликации
Онкогенные ретровирусы
Недефектные (nondefective) вирусы
FeLV (feline leukemia virus вирус кошачей лейкемии)
MMTV (mouse mammary tumor virus)
Acute (острые) transforming viruses
47

48.

Сравнение геномов неонкогенного и онкогенного ретровирусов
Идентичност
ь
(%)
Участки, потерянные в v-onc
Ген
Изменения в
соответствующих
участках
mos
11/369 замен
97
Нет
H-ras
3/189
98
Нет
K-ras
7/189
96
Нет
sis
18/220
92
Нет
myc
2/417
99
Нет
src
16/514
97
19 аминокислот на С-конце
fms
20/930
98
50 а-т на С-конце
erbB
99/600
83
Половина N-конца и С-конец
(всего 610)
erbA
22/396
95
12 а-т на N-конце
myb
11/372
97
N- и С-концы (268 всего)
48

49.

Клеточные прото-онкогены:
середина-1970х: J. M. Bishop & H. Varmus (Nobel
Prize 1989)
Клетки животных в норме содержат гены,
близко родственные вирусным онкогенам.
Mukherjee, S. (2010). The Emperor of All Maladies: A Biography of Cancer. New
York: Scribner. p.160
49

50.

Клеточные прото-онкогены:
середина-1970х: J. M. Bishop & H. Varmus (Nobel
Prize 1989)
Клетки животных в норме содержат гены,
близко родственные вирусным онкогенам.
начало-1980х: R. A. Weinberg & M. Wigler
Различные
раковые
клетки
содержат
онкогены, которые способны к трансформации
клеток культуры и появлению раковых клеток.
50

51.

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1989
“for their discovery of the cellular origin of retroviral oncogenes"
J. Michael Bishop
Harold E. Varmus
1/2 of the prize
1/2 of the prize
USA
USA
University of California
School of Medicine
San Francisco, CA, USA
University of California
School of Medicine
San Francisco, CA, USA
b. 1936
b. 1939
51

52.

Онкогены, присутствующие в ретровирусах
Вирус
Название
Организм
Опухоль
Онкоген
Rous sarcoma
RSV
chicken
sarcoma
src
Harvey murine sarcoma
Ha-MuSV
rat
sarcoma
H-ras
Kirsten murine sarcoma
Ki-MuSV
rat
sarcoma
K-ras
Moloney murine sarcoma
Mo-MuSV
mouse
sarcoma
mos
FBJ murine osteosarcoma
FBJ-MuSV
mouse
chondrosarcoma
fos
Simian sarcoma
SSV
monkey
sarcoma
sis
Feline sarcoma
PI-FeSV
cat
sarcoma
sis
Feline sarcoma
SM-FeSV
cat
fibrosarcoma
fms
Feline sarcoma
ST-FeSV
cat
fibrosarcoma
fes
Avian sarcoma
ASV-17
chicken
fibrosarcoma
jun
Avian myelocytomatosis
MC29
chicken
carcinoma,
sarcoma
myc
Abelson leukemia
MuLV
mouse
B cell lymphoma
abl
Avian erythroblastosis
AEV
chicken
erythroleukemia
& fibrosarcoma
erbB,A
52

53.

Идентификация и клонирование онкогена
Клетки опухоли
Выделение ДНК
Трансфекция клеток
дикого типа
Интеграция
мутантного гена
Колония
трансформированных
клеток
Выделение мутантной ДНК 53

54.

ДНК из карциномы
мочевого
пузыря человека
Трансфекция культуры клеток
NIH 3Т3 мыши
Идентификация
и клонирование
онкогена ras
Культивирование (2 недели)
Фокус
трансформированных
клеток
Выделение ДНК,
трансфекция клеток
Второй цикл
Выделение ДНК
Pulciani S. et al. Oncogenes in human tumor
cell lines: molecular cloning of a transforming
gene from human bladder carcinoma cells.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1982;79(9):2845-9.
Shimizu K et al., Molecular cloning of an
activated human oncogene, homologous to v-raf,
from primary stomach cancer. Proc Natl Acad Sci
U S A. 1985, 82(17):5641-5.
54

55.

Выделение ДНК
ДНК человека
Библиотека генов
мыши
Клонирование ДНК
в фаге λ
Идентификация
и клонирование
онкогена ras
Высев фагов
на газон E.coli
Гибридизация
с Alu-пробой
Alu-проба
Перенос
на фильтр
Онкоген
55

56.

Выделение ДНК
ДНК человека
Библиотека генов
мыши
Клонирование ДНК
в фаге λ
Идентификация
и клонирование
онкогена ras
Высев фагов
на газон E.coli
Изолированная ДНК может
трансформировать клетки
Гибридизация
с Alu-пробой
Alu-проба
Проверка
Перенос
на фильтр
Онкоген
56