Экстракция биологически активных веществ тимьяна и их противогрибковые свойства

1. Экстракция биологически активных веществ тимьяна и их противогрибковые свойства

БУ ВО Ханты-Мансийского автономного округа – Югры
«СУРГУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Институт естественных и технических наук
Кафедра химии
Думать.
Действовать.
Достигать.
Экстракция биологически активных
веществ тимьяна и их
противогрибковые свойства
Выполнил: студент 4 курса группы 301-11
Кирилин Илья Владимирович
Научный руководитель: к.т.н., доцент
Бараненко Денис Александрович

2.

Актуальность
Рост антибиотикорезистентности – серьезная угроза
здоровью, что повышает спрос на новые природные
антибактериальные средства.
Преимущества растительных экстрактов (тимьяна)
– меньше побочных эффектов и высокая биосовместимость
по сравнению с синтетическими препаратами.
Недостаточная изученность гидропонного тимьяна
– его биоактивный состав и свойства в условиях
беспочвенного выращивания исследованы фрагментарно,
что требует детального анализа.
2

3.

Цели и задачи
Цель: оптимизация условий экстракции биологически активных веществ из тимьяна обыкновенного
с использованием метода ультразвуковой экстракции и определение противогрибковых свойств
экстрактов.
Задачи исследования:
1. Определить параметры ультразвуковой экстракции, влияющие на выход биологически активных
веществ и выявить среди них оптимальные.
2. Оценить
фунгиостатическую
активность
полученных
экстрактов
в
отношении
тест-культур
микроорганизмов методом диско-диффузионного анализа с последующей оценкой зон ингибирования
роста микроорганизмов.
73

4.

Объекты исследования
Растительное
обыкновенный
"Змейка"
сырье:
(Thymus
(белые
и
Тимьян
сорт
vulgaris)
цветные
лампы)
выращенный гидропонным методом.
Экстракты Thymus
vulgaris
Водно-спиртовые вытяжки: содержание
этанола 10–80%.
Штаммы:
F1119
Aspergillus
niger,
Geotrichum
candidum,
alternata.
(Национальный
биоресурсный
центр
Всероссийская
коллекция
промышленных
F525
F226
Alternaria
микроорганизмов
«Курчатовский институт»)
НИЦ
Aspergillus
niger
Alternaria
alternata
Geotrichum
candidum 7
4

5.

Оборудование и методы исследования
Cпектрофотометр
«Shimadzu UV-1900i»1
Ультразвуковая ванна
«Nordberg NU20»3
Высокоэффективный
жидкостный хроматограф
«Милихром A-02»2
Мельница
лабораторная
«ЛЗМ – 1М»
1. λ = 765 нм
2. Подвижная фаза: элюент А – [4М LiClO4 – 0.1M HClO4] : H2O (5:95),
элюент Б – ацетонитрил (CH3CN). Режим хроматографирования градиентный.
3. Частота 40 кГц, мощность нагрева 100 Вт, мощность УЗ 80 Вт.
Вибростенд
«ЭКРОС 6700 (ПЭУ 6700)»
75

6.

Схема оптимизации параметров экстракции
Оптимизация параметров
экстракции
Изменение размера частиц и
температуры экстракции
Размер
частиц:
0.2-0.5
0.5-1.0
1.0-2.0
мм
Температура:
20, 30, 40, 50,
60, 70
˚С
Изменение
концентрации
экстрагента (этанола)
Время:
2, 5, 10,
15, 20
мин
Соотношение
сырье/экстрагент:
1:30, 1:50, 1:100
Изменение
времени
экстракции и
соотношения
сырье/экстрагент
Концентрация спирта:
10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80%
Оптимальные условия
76

7.

Оптимизация условий получения
растительных экстрактов
Таблица 1 - Содержание фенолов в T. vulgaris (мг/г) при
исследовании влияния размера частиц и температуры
экстракции*
y = 11.469х + 0.0182
R2 = 0.9997
Размер частиц, мм
Температура, ˚С
0.2-0.5
0.5-1.0
1.0-2.0
20
24.4±0.7
9.7±0.5
5.5±0.1
30
26.6±0.8
9.8±0.3
6.1±0.1
40
28.6±0.7
12.5±0.4
6.7±0.1
50
32.0±0.7
14.5±0.4
7.4±0.1
60
31.8±1.3
14.9±0.4
10.0±0.2
70
35.1±0.9
18.7±0.2
11.2±0.1
*Результаты выражены в эквивалентах галловой кислоты
Галловая кислота, мг/мл
Зависимость концентрации галловой кислоты от оптической
плотности (λ = 765 нм)
77

8.

Оптимизация условий получения
растительных экстрактов
Таблица 2 - Содержание фенолов в T. vulgaris (мг/г) при
исследовании влияния времени экстракции и соотношения
сырье : экстрагент*
Оптимальные условия:
Соотношения сырье : экстрагент
Время, мин
1:30
1:50
1:100
2
34.5±1.1
41.0±1.6
62.2±3.1
5
40.0±0.6
50.2±1.4
64.3±1.5
10
39.1±0.7
52.2±1.3
66.6±2.5
15
39.6±0.9
52.4±0.7
71.4±2.8
20
38.9±3.5
51.4±1.6
59.0±3.1
Время экстракции: 15 мин
Соотношение сырье/экстрагент: 1:100,
Размер частиц: 0.2 - 0.5 мм
Температура: 70 ˚С
Концентрация экстрагента: 50%
Таблица 3 - Содержание фенолов в T. vulgaris (мг/г) при исследовании
влияния концентрации экстрагента*
Концентрация
спирта, %
Концентрация
фенолов, мг/г
10
20
30
40
50
60
70
80
23.4±0.6 26.3±1.3 29.3±0.8 30.7±0.8 32.2±2.5 31.6±3.2 28.5±3.7 25.6±2.0
*Результаты выражены в эквивалентах галловой кислоты
78

9.

Оптимизация условий получения
растительных экстрактов
Содержание Тимола в T. vulgaris (мг/г) методом ВЭЖХ
Концентрация спирта, %
Концентрация тимола, мг/мл
10
0.7±0.1
20
0.9±0.1
30
1.3±0.1
40
1.7±0.2
50
1.8±0.2
60
1.8±0.2
70
1.7±0.2
80
1.6±0.2
Тимол
Хроматограмма спиртового экстракта T. vulgaris
78

10.

Схема фунгиостатической активности
Подготовка посуды
(стерилизация в сухожаре)
165°C на 2,5 часа
Инкубация 2 суток
при 25-28 °C
Закладка каждого
варианта экстракта
в 3 повторностях
Перенос суспензии спор
гриба в чашки со средой
(100 мкл)
Приготовление
скошенного агара
(среда Мальц-экстракт)
0,5 атм 30 мин
Измерение зон
ингибирования
Засев культур
79

11.

Фунгиостатическая активность T. vulgaris
в отношении коллекционных штаммов
Контроль
этанол 50 %
Контроль
этанол 50 %
Тимьян
обыкновенный сорт
«Змейка »(ЦЛ)
Этанол 50 %
Тимьян
обыкновенный сорт
«Змейка »(БЛ)
Этанол 50 %
F226 Geotrichum candidum
Тимьян
обыкновенный сорт
«Змейка »(БЛ)
Этанол 50 %
Тимьян
обыкновенный сорт
«Змейка »(ЦЛ)
Этанол 50 %
F1119 Aspergillus niger
Тимьян
обыкновенный сорт
«Змейка »(ЦЛ)
Этанол 50 %
Тимьян
обыкновенный сорт
«Змейка »(БЛ)
Этанол 50 %
F525 Alternaria alternata
Тимьян змейка (БЛ):
9,2±0,5 мм
Тимьян змейка (ЦЛ):
12,7±0,7 мм
10

12.

Выводы
1. Определены оптимальные параметры ультразвуковой экстракции биологически активных веществ (БАВ) из тимьяна
обыкновенного.
Время экстракции: 15 минут
Соотношение сырье : экстрагент: 1:100
Размер частиц сырья: 0,2–0,5 мм
Температура экстракции: до 70 °C
2. Методом диско-диффузионного анализа установлено, что экстракты тимьяна обладают хорошей фунгиостатической
активностью.
Тимьян змейка (ЦЛ): 12,7 ± 0,7 мм
Тимьян змейка (БЛ): 9,2 ± 0,5 мм
711