Оптические методы количественного анализа. Контроль качества лабораторных исследований

1. Оптические методы количественного анализа. Контроль качества лабораторных исследований

В.И. Южаков

2. Контроль качества лабораторного исследования

Это система мер по контролю за качеством
выполнения лабораторного анализа на
всех этапах его осуществления — от
периода
подготовки
пациентов
к
процедуре
взятия
материала
до
использования полученных результатов в
клинике. Осуществляется ежедневно.
Основные
критерии
КК:
воспроизводимость и правильность
полученных результатов

3. Основные этапы КК

1. преаналитический
пациента,
материала,
обработка,
хранение);
(подготовка
взятие
биологического
его
предварительная
транспортировка
и
2. аналитический (контроль процедуры
дозирования, проведения реакции, т.е.
перемешивания,
термостатирования,
соблюдения
необходимого
времени
реакции, измерения и др.), расчет
результатов;
3. постаналитический (правильность
оформления бланка с результатами, их
лабораторно-клиническую
интерпретацию, доведение полученной
информации до сведения врача).

4. Основные группы аналитических методов.

1.
Дефинитивные (окончательные) — методы,
2.
Референтные
3.
признанные
ошибок.
не
имеющими
источников
методы
выполняемые
с
помощью
доступного
оборудования.
Позволяют
получать
результаты,
статистически
неотличимые
от
устанавливаемых
с
использованием
дефинитивных
методов
(аналитическая
ошибка определения составляет примерно
1%).
Рутинные методы. Методы,
рекомендованные ассоциациями
специалистов, а также официально
утвержденные методы клиникобиохимических исследований, применяемые в
повседневной практике лабораторных работ.

5. Внутренний контроль качества

Включает:
1)Контроль правильности
2)Контроль воспроизводимости
Правильность – качество измерений, отражающее
близость к нулю систематических погрешностей
в их результатах, то есть соответствие среднего
значения результатов измерений с истинной
величиной измеряемого параметра. Причиной
отклонения от правильного результата является
систематическая ошибка.
Воспроизводимость – качество измерений,
отражающая степень разброса результатов
измерения. Причиной разброса результатов
(аналитической вариации) являются случайные
ошибки.

6. Наиболее характерные систематические ошибки

1.
2.
3.
4.
Ошибки методические - некачественно протекает
реакция, влияние посторонних примесей и т.д.
Ошибки, зависящие от применяемых приборов, их
состояния
и
реактивов
(неточные
весы,
нечувствительность фотоэлементов, загрязнение
растворов, неправильно выбранный светофильтр,
сбивка длины волны, использование реагентов с
истекшим сроком годности, загрязненная вода и
т.п.).
Ошибки
оперативные.
Неправильное
или
недостаточно
тщательное
выполнение
аналитических операций (неточный отбор растворов,
пробы, разведение, нарушение температурного
режима и др.).
Ошибки, допущенные при обработке стандарта,
построения калибровочного графика, вычислении
фактора пересчета и составлении калибровочной
таблицы.

7. Виды контрольных материалов

1. Специальные контрольные
материалы – изготовленны
промышленным
путем
(Сероконт
В
–контроль
воспроизводимости, Сероконт
П – контроль правильности,
и т.д.).
2. Слитая сыворотка.
Используется для контроля
воспроизводимости

8. Внутрилабораторный контроль правильности с контрольным материалом

Статистический критерий Лорда (L).
Выполнение: 10-20 параллельных проб контрольного
материала, Расчет Х, сравнение со средней величиной,
указанной для контрольного материала.
X
L
X макс Х мин
Х - средняя величина из 10-20 проб;
μ- среднее значение контрольной сыворотки;
Хмакс - максимальное значение из 10-20 проб;
Хмин - минимальное значение этого же ряда.
При L≤0,23 различие недостоверно – правильность
результатов.
Критерий Лорда можно использовать только тогда,
когда воспроизводимость результатов в лаборатории
удовлетворительная.

9. Внутрилабораторный контроль правильности с контрольным материалом

Разностный метод критерия t Стьюдента.
1. Вычисляют разность между результатом
определения и истинной величиной. Затем находят
сумму разностей (с учетом знаков) и среднее
значение этой разности:
разностей
М
п
2. Устанавливают отклонение от среднего значения
разности и возводят в квадрат, определяют сумму
найденных показателей (D2) и значение средней
ошибки по формуле:
D2
Sx
(n 1) n
Затем рассчитывают значения существенности разности t:
t =X \ S x
Если t ≥ 2,0
неправильны
различия
достоверны,
результаты

10. Внутрилабораторный контроль воспроизводимости

Основные этапы:
1. Определение концентрации вещества
в сыворотке типа Сероконт –В и
установление расчетных параметров
для дальнейшего контроля.
2. Статистическая
обработка
полученных результатов.
3. Построение контрольных карт.
4. Оценка
контрольных
карт
по
предупредительным и контрольным
критериям.

11. Этапы внутрилабораторного контроля воспроизводимости

1. Накопление результатов
исследований сыворотки на
воспроизводимость.
23-25 дней определяют содержание
аналита в контрольном материале (в 2
параллелях), наряду с опытными
пробами.
Вычисляют среднюю величину
каждого параметра из двух
параллельных проб (Х).
Х
Х
n

12. Этапы внутрилабораторного контроля воспроизводимости (продолжение)

2. Статистическая обработка результатов
Анализ результатов, удаление крайних
Расчет средней арифметической за 25 дней
Расчет среднеквадратичного отклонения и
коэффициента вариации
Сравнение с ДПО
Предел достоверности ±2S. Выходящие за пределы
результаты
отбрасывают
и
производят
перерасчет.
Х Х
S
2
n 1
S
V % х100%
Х

13. (продолжение)

Допустимые пределы аналитической вариации
№
п/п
Анализируемый
компонент
V
%
№
п/п
Анализируемый
компонент
V
%
1.
Адреналин
7
12.
уГлутамилтранспептидаза
10
2.
Аланинаминотрансфераз
а
7
13.
Железо
5
3.
Альбумин
3
14.
Калий
2
4.
альфа-Амилаза
10
15.
Кальций
2
5.
Аммиак
5
16.
Кортизол
7
6.
Аспартатаминотрансфер
аза
7
17.
Креатинии
5
7.
Белок общий
3
18.
Креатинкиназа
7
8.
Белковые фракции
8
19.
Лактатдегидрогеназа
7
9.
Билирубин
10
20.
Липиды общие
5
10.
Глюкоза
5
21.
Магний
2
11.
Глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа
8
22.
Медь
5

14. Допустимый предел ошибок (ДПО)

Допустимый диапазон аналитического
рассеивания (критерий Тонкса) зависит
от пределов физиологических колебаний
компонентов. Требования к точности
исследований едины для всех
лабораторий.
верхнийпределнижнийпредел
1 нормальнойобласти нормальной области
ДПО%
100%
8 среднюювел ичину

15. Продолжение

3. Построение контрольной карты
На бумаге откладывают
значения
Х и отклонения ±2S для
контрольного образца. Ось абсцисс
– дни, ординат – значения.
Продолжают исследовать
контрольную сыворотку той же
серии ежедневно, откладывая
среднее значение 2-х проб на карте.

16. Оценка контрольных карт

Предупредительные критерии:
1.Шесть результатов подряд находятся
по одну сторону от средней линии
2. Три результата подряд за пределами
±1S
3. Один результат за пределами ±2S
4. Шесть результатов подряд имеют
тенденцию наклона в одну сторону от
средней.
Действие врача: Проверить качество
калибровочных или стандартных
растворов, реактивов, измерительных
приборов, субъективные причины.

17. Оценка контрольных карт

Контрольные критерии:
1. Восемь результатов подряд находятся
по одну сторону от средней.
2. Пять результатов подряд
расположены за линией ±1S
3. Три результата выходят за ±2S.
4. Один результат выходит за пределы
±3S.
Действие врача: Прекратить выдачу
результатов анализов в клинические
отделения. Проверить все этапы
производства анализов. Срочно
провести контроль правильности.

18. Межлабораторный (внешний) контроль качества

Цель:
1. Выявить и устранить ошибки,
допускаемые в разных лабораториях
2. Достичь сравнимых результатов в
лабораториях.
Условия:
1. Проводится не реже 1 раза в квартал
2. Организуется участие не менее 20
лабораторий.
3. Заранее
определяется перечень
контролируемых
параметров
и
контрольная программа.

19. Основные отличия внутреннего и внешнего контролей качества

Внутренний
контроль:
Внешний
контроль:
- организует и проводит
лаборатория
- проводит некая
организация
- ежедневно
- периодически
- лучше выявляет
случайные ошибки
- лучше выявляет
систематические
ошибки

20. Мероприятия контрольного центра при осуществлении межлабораторного контроля качества.

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Определение даты и срока проведения контроля;
Выбор, оповещение и регистрацию участвующих
лабораторий (кодирование);
Составление и размножение протокола контрольных
определений и контрольной программы
(инструкции) для участника межлабораторного
контроля качества;
Определение срока подачи результатов контрольных
исследований;
Рассылка контрольных образцов;
Сбор результатов контрольных определений;
Статистическую обработку полученных данных;
Оценку качества работы участвующих лабораторий
(общая и индивидуальная), рекомендации для
устранения источников ошибок (не позже месяца
после получения ответов).

21. Контрольная программа при проведении внешнего контроля качества

Составляется контрольным центром,
включает:
1. условия хранения и растворения
контрольного материала
2. перечень контрольных исследований
3. дата и срок проведения контрольных
исследований
4. срок представления полученных
результатов
5. точный адрес контрольного центра
6.
дополнительная информация (по
усмотрению).

22. Внешний контроль правильности результатов исследований

1. Сравнение результатов тестируемой
лаборатории с результатами референтных
лабораторий.
x
IS
ЛАБ
M
S
Хлаб - результат лаборатории, которую
оценивают; М и S - паспортные данные
контрольной сыворотки (истинное значение и
среднеквадратическое отклонение).
Полученный результат считается приемлемым
в том случае, если величина IS не превышает
2,0 балла.
2. Оценка общей сравнимости отдельных
лабораторий по скорригированным величинам
Х и S.

23. Внешний контроль воспроизводимости

1. Рассчитывают коэффициент
вариации по каждому
тестируемому компоненту
2. Производят
сравнение
с
величиной допустимого предела
ошибок (формула Тонкса).

24. ОБРАЗЕЦ ПРОТОКОЛА ИССЛЕДОВАНИЯ

1.
Протокол биохимических определений.
Адрес учреждения ...........
Тип учреждения ...........
Код ...........
Зав. лабораторией. ..........
Ответственный за контроль. ......
Дата проведения контроля
№
п/п
Показатели
1.
Общий белок
2.
Холестерин
3.
Глюкоза
4.
Мочевина
5.
Креатинин
Метод
Подпись
Прибор,
реактивы
(указать фирму)
Результаты
исследован
ия и ед.
измерения

25. Графическое изображение результатов межлабораторного контроля качества

26. Оптические методы

27.

28.

29.

30.

31. Физико-химические методы в лабораторной аналитике Оптические методы

В клинической лабораторной диагностике широко
используются оптические методы.
Это связано с их доступностью, большой
информативностью: можно определить такие основные
параметры биохимии, как сыворотку крови; ферменты
плазмы; электролиты плазмы крови; основные
метаболиты - азотистые основания; сахар и др.,
возможно исследование СОЭ в динамике, проведение
иммуноферментного анализа.
Приборы могут быть как сложной конструкции для тонкого
анализа биологических сред, так и простые, компактные и
дешевые, ручные, полуавтоматические и автоматические.
Оптические методы основаны на взаимодействии вещества
с оптическим излучением: вещество может его
поглощать, рассеивать, отражать, пропускать,
излучать и т.п. Оптические методы включают в себя
следующие:

32. Рефрактометрия

– метод измерения показателя
преломления света при
прохождении его через оптически
неоднородные среды.
Сейчас он уже не применяется в
лабораторной диагностике, так как
дает завышенные результаты.
(раньше он использовался для
определения содержания общего
белка в плазме или сыворотке
крови).

33. Поляриметрия

– метод основан на свойстве
прозрачных веществ вращать
плоскость поляризованного
луча света.
Он применяется в лазерных
поляриметрах для
определения глюкозы в моче

34. Фотометрия

– это измерение интенсивности
света, прошедшего через вещество
(твердое или в виде раствора).
Фотометрические методы – это
методы количественного анализа,
основанные на переведении
аналитов в поглощающие свет
соединения с последующим
определением их количества путем
измерения светопропускания или
светопоглощения растворов.

35.

Это наиболее распространенные методы
биохимических исследований – определение
параметров сыворотки, плазмы крови, ферментный
анализ, и др.
Абсорбционная фотометрия – измеряется
энергия поглощения растворов.
Отражательная – измеряется свет, отраженный
исследуемой поверхностью.
Нефелометрия – определение концентрации,
размеров и формы частиц во взвесях, эмульсиях,
коллоидах по измерению интенсивности
светорассеяния.
Эмиссионная фотометрия (спектроскопия) – это
измерение света, излучаемого частицами
вещества.

36. Виды абсорбционной фотометрии.

Фотоколориметрия – метод, в котором при
измерении не выделяется узкий диапазон длин
волн, а измеряются характеристики всего
светового потока в видимом диапазоне света.
Более общее название метода –
колориметрический. Его сущность заключается в
измерении интенсивности цвета раствора
неизвестной концентрации путем сравнения с
интенсивностью цвета стандартного раствора.
Если измерение визуальное – то прибор
называется колориметром.
Если детектор фотометрический – то это
фотоколориметр.

37. Фотометрия

предполагает выделение
оптического диапазона,
характерного для поглощения
данным веществом, с
помощью светофильтров
(фильтровой фотометр).
Приемником (детектором)
служат фотоэлементы.

38. Спектрофотометрия

– основана на использовании
монохроматора – устройство,
позволяющее выделять пучок
света с любой длиной волны,
а само излучение на одной
частоте и соответствующей ей
длине волны называется
монохроматическим

39. Турбидиметрия

– метод фотометрического измерения
поглощения света взвешенными в растворе
частицами определяемого вещества, т.е.
измерение света, прошедшего через
мутный раствор. Измерения проводят
обычно на фотометрах для ручных и
полуавтоматических измерений, а также с
помощью биохимических анализаторов,
основанных на фотометрической детекции.
Измерения используют в методах
гомогенного иммунохимического анализа,
например, при определении
индивидуальных белков на основе реакции
«антиген-антитело».

40. Атомно-абсорбционная фотометрия.

Это спектральный метод,
основанный на способности ионов,
находящихся в плазме поглощать
кванты света. Метод позволяет
определить общее содержание
элемента в исследуемой пробе, не
зависимо от того, в какой форме он
находится: свободной, связанной с
белком или низкомолекулярным
веществом и .п.

41. Принципы фотометрии.

Поток световой энергии, переносимый через единицу
площади называется интенсивностью потока световой
энергии.
Если на исследуемую среду падает световой поток с
интенсивностью I0 , то он будет складываться из
следующих слагаемых:
I0=Ia + Iотр +Iрасс +I
Интенсивность падающего = интенсивность
поглощенного (абсорбированного)+
отраженного+рассеянного+интенсивность прошедшего.
Можно подобрать такие условия, при которых
интенсивностью отраженного и рассеянного света можно
пренебречь, тогда
I0=Ia + I
(то есть интенсивность падающего света складывается
из интенсивностей поглощенного и прошедшего света).

42.

Отношение I прошедшего света к
падающему I0 называется
коэффициентом пропускания:
T=I/I0 * 100%– коэффициент
пропускания, мера прозрачности
раствора
D=lgI0/I – оптическая плотность
раствора, мера непрозрачности
раствора.
D=lgl / T – где l – толщина
поглощающего слоя.

43. Закон Бугера-Ламберта Бера:

Оптическая плотность раствора зависит от
толщины поглощающего слоя (l) (или
внутреннего размера кюветы), концентрации
поглощающего вещества и поглощающей
способности исследуемого вещества в растворе:
D = klC, с-концентрация
Коэффициент k – показатель поглощения,
постоянная величина, зависящая от длины
волны и природы вещества.
Если l- в см, С – в моль/л, то k=ελ – молярный
показатель поглощения (молярый коэффициент
погашения или абсорбции).

44.

Он характеризует свойство вещества
поглощать свет на данной длине волны
оптического излучения при определенных
условиях: температуре, рН, растворителе
и др. Молярный показатель поглощения
равен оптической плотности раствора с
концентрацией вещества 1 моль/л при
длине кюветы = 1 см.
Оптическая плотность раствора
прямопропорциональна концентрации
(при постоянном значении толщины
поглощающего слоя):

45.

ελ – зависит от структуры вещества и не зависит от
его
концентрации.
Величину
коэффициента
поглощения используют для характеристики веществ,
оценки их чистоты. Его значения колеблются от
единиц до сотен тысяч. Чем больше его значение, тем
больше
чувствительность
метода.
При
фиксированной длине кюветы оптическая плотность D
и концентрация растворенного вещества С связаны
через молярный коэффициент поглощения.
По результатам измерения оптической плотности
раствора с удобной концентрацией можно рассчитать
молярный коэффициент поглощения.
Так как ε является функцией длины волны, то
зависимость ε (λ) может служить количественной
характеристикой спектра вещества.
Закон Бугера-Ламберта-Бера лежит в основе всех
методов фотометрии в любой области оптического
спектра.

46. Устройство фотометров и спектрофотометров.

Оптические приборы, измеряющие
полихроматический световой поток
только в видимом диапазоне света
называют
фотоэлектроколориметрами.
Приборы, измеряющие
полихроматический световой поток
в УФ, Видимом и ИК диапазоне
называются фотометрами.

47.

48.

49.

50.

51.

52.

53. СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !!!