Электрохемилюминесцентный иммуноанализ (ЭХЛА, ECLIA)

1.

Электрохемилюминесцентный
иммуноанализ (ЭХЛА, ECLIA)
ОМТ, ноябрь 2022
докладчик: заведующий КДЛ, директор лабораторного направления,
врач-гемостазиолог МЦ ОЛМЕД

2.

Терминология
Разберем название метода: электро-хеми-люминесцентный иммуно-анализ
1. Разбирать название метода начнем с конца
«Иммуно» - означает, что в основе реакции определения целевого маркера (как
биологического, так и ксенобиотика) лежит высокоспецифическая реакция АНТИГЕНАНТИТЕЛО
«Люминесцентный» – в основе детекции сигнала лежит принцип «свечения» реакционной
смеси
«Хеми» – в основе «свечения» лежит протекающая химическая реакция
«Электро» – основой механизма запуска окислительно-восстановительной реакции
является подача напряжения на электрод (рутений – окислитель, трипропиламином –
восстановитель)

3.

Принцип метода (1)
Электрохемилюминесцентный иммуноанализ (ECLIA)
представляет собой количественный метод измерения антигена или
антитела, основанный на изменении сигнала
электрохемилюминесценции (ECL) до и после иммунореакции.
Иммуноанализ (ECLIA) представляет собой количественный метод
измерения антигена или антитела, основанный на изменении
сигнала электрохемилюминесценции (ECL) до и после
иммунореакции. ECL - это процесс, при котором частицы,
образующиеся на электроде, подвергаются реакции переноса
электронов высокой энергии с образованием возбужденных
состояний, которые излучают свет. Аналогично CL, ECL не требует
использования внешних источников света. Хотя ECL является
формой CL, он обладает рядом преимуществ по сравнению с CL,
которые мы обсудим позже.

4.

Принцип метода (2)
Электрохемилюминесценция отличается от
хемилюминесценции тем, что активные вещества, которые
вызывают хемилюминесцентную реакцию, электрохимически
генерируются из стабильных предшественников на поверхности
электрода. Трис (2,2’- бипиридин) рутений (II) на основе
прямого метода ЭХЛ является наиболее часто используемой
электрохемилюминесцентной меткой, и
электрохемилюминесценция генерируется на электроде в результате
реакции окислительно–восстановительного типа с
трипропиламином. Этот хелат стабилен и относительно мал, и его
использовали для маркировки гаптенов или крупных молекул
(например, белков, олигонуклеотидов).

5.

Принцип метода (3)
Трис (2,2’- бипиридин) рутений (II) подвергается
электрохемилюминесцентной реакции (620 нм) с трипропиламином
на поверхности электрода, и этот хелат в настоящее время
используется в качестве метки в конкурентных и многослойных
электрохемилюминесцентных иммуноанализах. Используя эту
метку, были разработаны различные анализы с использованием
магнитных шариков в качестве твердой фазы. Гранулы
захватываются магнитом на поверхности электрода в проточной
ячейке, а несвязанная метка вымывается из ячейки промывочным
буфером. Метка, прикрепленная к шарику, подвергается
электрохемилюминесцентной реакции, и излучение света
измеряется фотоумножителем.

6.

Принцип метода (схема)

7.

Механизм
Фотон (ECL сигнал)
Рутений (Ru) комплекс
Магнитная
микрочастица
TPA
Рисунок 1 Изображение электрохимической светогенерирующей репортерной
системы для ECLIA
https://www.roche.com/
en.lifotronic.com

8.

Электрохемилюминесцентная технология для иммуноанализа
Преимущества
A
B
C
D
Рисунок 4 Сравнение показателей ECL и CL

9.

Преимущества ЭХЛА перед ИХЛА
Во-первых, в ECL электрохимическая реакция позволяет
контролировать время и положение светоизлучающей
реакции. Контролируя время, излучение света можно
отложить до тех пор, пока не произойдут такие события,
как иммунные реакции или реакции, катализируемые
ферментами. Управление положением может быть
использовано для ограничения светового излучения.
Преимущества этого процесса включают (1) улучшенную
стабильность реагентов, (2) простое приготовление
реагентов и (3) повышенную чувствительность. При его
использовании могут быть получены пределы
обнаружения 200 фмоль/л и динамический диапазон,
простирающийся на шесть порядков величины.

10.

Прибор еCL8000
1. 3D Роботизированная рука
2. Картридж реагентов
3. Область сканирования реагенов
4. Позиция штативов
5. Принтер
6. Сенсорный экран
7. Картридж системные реагенты
8. Реакционный планшет
9. 2D Роботизированная рука

11.

Структурный состав
Прибор включает модуль подготовки материала (содержит кюветы и
штатив для образцов), модуль подачи жидкостей, модуль контроля температуры, модуль
механического перемещения (содержит зонд для подачи реагента/образца и
аспирационный зонд), модуль оптической регистрации (содержит измерительную ячейку),
модуль контроля линии связи и программного обеспечения.
Устройство состоит из аналитического блока и блока управления. Аналитический модуль
обеспечивает функции внесения образцов и реагентов, необходимых для полностью
автоматизированной иммунологической реакции и анализа, автоматическое
сканирование образцов пациента, электрохимическое измерение, передачу результата, и
т.д. Блок управления управляет анализатором для ввода и вывода данных, оценки
результатов, калибровки устройства и общего контроля качества.

12.

Принцип метода
иммунной реакции
вариант «сэндвич»

13.

Принцип метода
иммунной реакции
вариант
«конкурентный анализ»

14.

Принцип метода
«визуализации»
вариант
«ЭХЛА»

15.

Принцип метода
«тонкие места»
Иммунная реакция
Качество реагентов: правила транспортировки и хранения на
складах и в лаборатории (температурный режим), иначе
контаминация и снижение аналитических характеристик
Качество перемешивания: нарушение качественного
прохождения реакции АГ-АТ
Качество инкубации: нарушение температурного режима
инкубации (37 град.) приводит с плохому взаимодействию АГ-АТ
и ухудшает аналитические характеристики реагентов

16.

Принцип метода
«тонкие места»
Измерение люминесценции
Качество отмывки: нарушение в отмывке может приводить к
завышению или занижению результатов исследований
Качество работы фотоумножителя, магнита и электрода,
напрямую влияют на качество исследований

17.

Метод
калибровки

18.

Lifotronic eCL8000
Набор Реагентов
Реагенты
Магнитная частица
Контроль качества
Разбавленная
жидкость
Калибровка
RFID
Рисунок 8 Набор реагентов

19.

Lifotronic eCL8000
Расходные материалы
Кюветы
Auffer
Buffer
Промывающий раствор
Буфер регулировки высокого напряжения
Реагент для регулировки высокого Measuring Cell Maintenance Buffer
напряжения

20.

Lifotronic eCL8000
Расходные материалы
NO
Item
Specification
1
Assay Cup
12& 120 sets
2
Auffer
480 mL&
6×480 mL
Shelf Life
after Opening
Shelf Life
/
Clarification
One cup per test; Nonrecyclable
Test times is influenced by interval time.
1. at least 130 test/ bottle for testing 10 samples continually;
2. at least 80-130 test/ bottle for testing 5-10 samples
3
Buffer
480 mL&
6×480 mL
continually;
3. at least 30-80 test/ bottle for testing 3 samples continually.
Diluted with deionized water for 1:9
1. at least 130 test/ bottle for testing 10 samples continually;
4
Concentrated
Washing Buffer
1×1 L
18 Months
4 Weeks
2. at least 80-130 test/ bottle for testing 5-10 samples
continually;
3. at least 30-80 test/ bottle for testing 3 samples continually.
5
Measuring Cell
Maintenance
Buffer
200 mL
Finished in 13 min per time; 3mL/ maintenance
6
High-voltage
Adjustment
Buffer
380 mL
2 mL/ T
7
High-voltage
Adjustment
Reagent
10 mL
2 mL/ adjustment

21.

Конкуренты ЭХЛА (метод)

22.

Электрохемилюминесцентная технология для иммуноанализа
Сравнение
Категория
Предметы
Типичные производители
Параметры
реакции
эффективность
Электрохемилюм Хемилюминесцент
ИХЛА
инесцентный
ного
иммунохемилюмин
иммуноанализ иммуноферментног есцентный анализ
(ELCIA)
о анализа (CLEIA)
(CLIA)
Lifotronic\ Roche
Beckman\ Mindray\ Simens Abbott\ Simens\ Johnson
Маркеры
Рутений-трис
Щелочная фосфатаза
(ALP) & Пероксидаза
хрена (HRP)
Стабильность
маркеров
Высокий
Низкий
Низкий
Молекулярный вес
маркеров
1.3 KD
about 56 KD& 44 KD
0.59 KD
фермент
Нет
Да
Да
Скорость реакции
Очень быстрая(~0.1s)
Медленная (~30 min)
Медленная (~1.5s)
Источник света
Равномерное
плоское свечение
Трубчатое свечение
Трубчатое свечение
Тип света
Стабильный
светящийся свет
Ослабление светящего
света
Вспышка
Длительность
световых сигналов
Продолжительный
Продолжительный
Короткий
Чувствительность
0.1 fmol (10-16 mol/L)
0.1 pmol (10-13 mol/L)
10 -15~-18 mol/L
эфиры/ изолюминол/
люминол

23.

Конкуренты еCL800

24.

Принцип «поточности»
исследований
Прием БМ
Утверждение и
выдача результатов
Интерпретация
результатов
Сыворотка
(пробирка с
красной или
желтой крышкой)
Исследования: БХ,
Гормоны,
Инфекции

25.

Благодарю за внимание
и хорошего Вам вечера
ОМТ, ноябрь 2022
докладчик: заведующий КДЛ, директор лабораторного направления,
врач-гемостазиолог МЦ ОЛМЕД