Основные лабораторные синдромы при заболеваниях печени. Практическое занятие №3

1. Основные лабораторные синдромы при заболеваниях печени практическое занятие №3.

2.

3. Цели обследования пациентов с подозрением на заболевание печени

выявление нарушений функций печени
оценка тяжести поражения печени
выявление структурных повреждений
печени
установление причины поражения
печени
выявление возможных осложнений

4. Лабораторные методы исследования

Биохимический анализ крови
Серологические реакции
Молекулярно-генетические
исследования
Лучевая диагностика
Инвазивные исследования

5.

Ферменты
плазмы / сыворотки
крови
СЕКРЕТОРНЫЕ
(конститутивные)
ФЕРМЕНТЫ
КЛЕТОЧНЫЕ
(индикаторные)
ФЕРМЕНТЫ
ЭКСКРЕТОРНЫЕ
(пищеварительные)
ФЕРМЕНТЫ

6. Ферменты в сыворотке / плазме крови

1. СЕКРЕТОРНЫЕ (КОНСТИТУТИВНЫЕ) ФЕРМЕНТЫ
• факторы свертывания крови и фибринолиза
• защитные факторы (пропердин, комплемент, лизоцим…)
• регуляторные факторы (ренин, ангиотензин, калликреин,
кинины…)
• холинэстераза, липопротеинлипаза, церулоплазмин
Снижение их активности часто свидетельствует о патологии
печени.

7.

Ферменты в сыворотке / плазме крови
2. ЭКСКРЕТОРНЫЕ (ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫЕ) ФЕРМЕНТЫ
• липаза, -амилаза, эластаза, трипсин, щелочная фосфатаза и др.
Синтез – в пищеварительных железах, в норме выходят в ЖКТ
(в кровь попадает очень небольшая часть ферментов).
Причины повышения их активности в крови:
• блокада экскреции в кишечник (закупорка или сдавление
выводных протоков)
• поражение пищеварительных желез (воспаление, травма
и т.д.)

8.

Ферменты в сыворотке / плазме крови
3. ИНДИКАТОРНЫЕ (КЛЕТОЧНЫЕ) ФЕРМЕНТЫ
• АЛТ, АСТ, ЛДГ, КК, ГГТ, ЩФ, КФ, СДГ и др.
Синтезируются и работают внутри клеток;
В норме попадают в кровь в минимальном количестве (при
обновлении клеточного пула).
Повышение их активности в плазме / сыворотке крови –
«сигнал» о повреждении / гибели клеток и выходе их
содержимого в межклеточное пространство и в кровь.
КЛЕТОЧНЫЕ ФЕРМЕНТЫ В КРОВИ
Органоспецифичные
(СДГ, уроканиназа)
Неспецифичные (подавляющее
большинство энзимов)

9. Внутриклеточная локализация ферментов

Цитоплазма (АЛТ, ЛДГ, СДГ,
основн.часть КК, часть АСТ)
ЭПР, микросомы (ГГТ)
Ядро
Клеточная мембрана
(ЩФ, ГГТ, ЛАП, 5’-НТ)
Лизосомы (КФ)
Митохондрии (ГлДГ, часть КК,
основная часть АСТ)
Повреждение клетки выход ЦП и ММ-связанных ферментов
выход ферментов, связанных с органеллами
(митохондриальных, лизосомальных …)

10. Активность ферментов в различных органах в сравнении с сывороткой крови

Орган
Печень
Почка
Головной мозг
Селезенка
Миокард
Скел. мышцы
Глад. мышцы
Эритроциты
АСТ
7000
4500
АЛТ
3000
1200
ЛДГ
700
500
700
8000
5000
150
500
300
600
700
15
7
500
КК
10
1700
5-8 тыс.
20-30 тыс.
300-600
0

11.

Механизмы гиперферментемии
при патологических состояниях
1. НЕКРОЗ КЛЕТОК => выход ферментов в межклеточное пространство и в кровь (КК, ЛДГ и АCТ при инфаркте миокарда)
2. ЦИТОЛИЗ – повреждение биомембран и потеря ферментов
из клеток + ускорение синтеза ферментов (АЛТ и ЛДГ при
вирусном гепатите)
3. УСКОРЕНИЕ СИНТЕЗА ФЕРМЕНТА при активации клеток
(костная ЩФ при рахите или заживлении переломов костей)
4. ЧРЕЗМЕРНАЯ АКТИВАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ в пораженном
органе или в кровяном русле (острый панкреатит, ДВС крови)
5. БЛОКАДА ЭКСКРЕЦИИ ФЕРМЕНТОВ в кишечник (ЩФ и ЛАП
при холестазе)

12.

ГИПОФЕРМЕНТЕМИЯ
Наблюдается значительно реже:
1. Уменьшение числа клеток, вырабатывающих
фермент (ХЭ при циррозах ПЧ)
2. Ускорение выведения ферментов из кровотока
(потеря амилазы, АЛТ / АСТ, церулоплазмина с
мочой при нефрозах)
3. Действие ингибиторов ферментов (КК при
гипертиреозе, ХЭ при отравлении ФОС).

13. ФЕРМЕНТОПАТИИ

ПЕРВИЧНЫЕ (наследственные)
• отсутствие фермента или его
недостаточный синтез
• аномалии структуры фермента (функциональная
неполноценность).
Часты нарушения метаболизма
Требуется ранняя диагностика
(пренатальная + скрининговое
обследование новорожденных)
ВТОРИЧНЫЕ – выход в
кровь ферментов при
повышении проницаемости
клеточных мембран:
• повреждение клеток и
тканей - механическое
(травмы, операции, манипуляции), бактериальное,
токсигенное (в т.ч. лекарствами)
• дефицит О2 и глюкозы
• гормональная патология,
гипо- и авитаминозы...

14. Ситуационная задача

22-летний молодой человек, употребляющий героин, обратился к
участковому терапевту с жалобами на рвоту, боль в животе и необычную
слабость, продолжающиеся в течение двух дней.
Отвечая на вопросы, он рассказал, что чувствовал себя не очень
хорошо и слегка лихорадил две недели назад, но эти симптомы прошли.
После этого он чувствовал себя вполне здоровым до появления
последних симптомов.
Врач назначил анализ крови для определения функциональных
печеночных проб.
Результаты получены следующие:
билирубин — 28 мкмоль/л;
альбумин — 42 г/л;
АлАТ
— 104 ЕД/л (нормальные показатели лаборатории < 20 ЕД/л);
ЩФ
— 56 ЕД/л (нормальные показатели лаборатории < 150 ЕД/л);
ГГТ
— 203 ЕД/л (нормальные показатели 50 ЕД/л).
1.
2.
3.
Какие лабораторные результаты отклоняются от нормы?
Какой возможный диагноз подтверждают результаты лабораторного
исследования?
Назовите дополнительные лабораторные тесты для подтверждения
диагноза.

15.

От чего зависит
активность фермента в крови?
(скорость синтеза + поступления в кровь + активации)
А= (скорость инактивации + выведения из кровотока)

16.

17. ЭНЗИМОДИАГНОСТИКА ПАТОЛОГИИ по определению вышедших в кровь клеточных ферментов

1. Определение
количества
фермента
(КК-МBmass,
панкреатическая
эластаза,
костная
ЩФ…)
Чувствительно к циркулирующим антителам и связывающим
белкам.
2. Определение активности фермента (скорость ферментативной реакции линейно зависит от концентрации
энзима). Проще, дешевле, но менее стабильно - могут
действовать ингибиторы.
Метод конечной точки
Кинетический метод
(более предпочтителен)

18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Оптимальные условия работы ферментов (V Vmax):
- Концентрация субстрата S 10 KM (насыщающая, но не избыточная). В ходе реакции должно израсходоваться не более 10%
субстрата.
- Оптимальная температура (37 0С, допустимо 30 0С или 25 0С).
- Значение рН среды, оптимальное для данного фермента
(состав и концентрация буферного раствора).
- Присутствие активаторов фермента (кофермент, кофакторы –
ионы металлов, определенные органические вещества).
- Отсутствие ингибиторов фермента.

19.

На активность энзимов влияют рH, состав и ионная
сила буфера. Обычная концентрация буферных
растворов - от 0,05 до 0,2 моль/л.
Первушин Ю.В., 2007

20.

Способы измерения скорости
ферментативной реакции
По конечной
точке
По начальной
скорости
Кинетическое
измерение
Двухточечное
кинетическое
измерение
Первушин Ю.В., 2007

21.

Измерение по конечной точке
инкубация
А + В -------> C + D
D + реаг. -> окраска
Определяется содержание конечных
продуктов реакции после
инкубации и остановки реакции
(добавление стоп-реагента).
Метод рассчитан на нормальную или несколько повышенную
активность фермента. При ее значительном росте быстро
расходуется субстрат и реакция замедляется.
Метод конечной точки относительно прост, но:
• занимает значительное время,
• может давать неточные результаты (интерференция лекарств
и химических веществ).
Нужны калибровочный график и холостая проба.
Субстрат + сыворотка (фермент) --> инкубация --> цветная
реакция --> измерение экстинкции (Е) против холостой пробы.
Первушин Ю.В., 2007

22.

А
Кинетический метод
Непрерывное (многоточечное)
измерение экстинкции.
Скорость реакции должна быть
постоянна на протяжении всего
измерения.
Метод дает быстрые точные результаты при строгом соблюдении
условий реакции (to, рН, [S], лаг-фаза).
Выполняется на фотометре или анализаторе.
Контроль и калибровка не нужны.
Субстрат + сыворотка (фермент) -> лаг-фаза 0,5-3,0 мин ->
измерение Е1 -> 1 мин -> измерение Е2 -> 1 мин -> измерение Е3 ->
1 мин -> измерение Е4 -> … (несколько раз, до начала уменьшения
Е/мин).
Расчет: ( Е/мин)1 = Е2 - Е1; ( Е/мин)2 = Е3 - Е2; ( Е/мин)3 = Е4 - Е3 …
Активность фермента = среднее значение Е/мин × фактор.
Первушин Ю.В., 2007

23.

Двухточечное кинетическое
измерение
После окончания лаг-фазы
измеряют экстинкцию дважды,
с промежутком 0,5 – 2 мин,
на линейном участке кривой.
Измерение по начальной
скорости (initial rate)
Фактически – кинетика, но скорость
реакции нелинейно снижается во
времени. Чаще пользуются
двухточечной кинетикой.
Первушин Ю.В., 2007

24. ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ к взятию биоматериала и пробоподготовке

- Кровь берется натощак.
- Сыворотка / плазма отделяется от клеток не позднее
1-1,5 часов после взятия.
- В первую очередь (как можно скорее) исследуются
менее стабильные ферменты - КК, КФ и др.

25.

Что лучше – плазма или сыворотка ?
(к вопросу о несовместимых антикоагулянтах)
-Амилаза - цитрат, ЭДТА, фторид
α-ГБДГ - оксалат
ГГТ - фторид, оксалат
Глутаматдегидрогеназа – фторид
Кислая фосфатаза - цитрат, ЭДТА, фторид, гепарин, оксалат
Креатинкиназа - цитрат, фторид, оксалат
Креатинкиназа-МВ - цитрат, ЭДТА, фторид, гепарин, оксалат
ЛАП - цитрат, ЭДТА, фторид, гепарин, оксалат
Лактатдегидрогеназа - фторид, оксалат
Липаза – ЭДТА, гепарин
Холинэстераза - ЭДТА, фторид, гепарин
Щелочная фосфатаза – цитрат, ЭДТА, фторид, оксалат
www.gbo.com/preanalytics
L. Thomas (2006)

26. Практические рекомендации при определении активности ферментов

Гемолиз, освобождение ферментов из лейкоцитов и
тромбоцитов могут вести к ложному завышению
активности
ЛДГ,
АСТ,
АЛТ,
КФ,
α-ГБДГ.
Риск гемолиза намного выше в сыворотке.
В тромбоцитах много ЛДГ и КФ => активность этих
ферментов в сыворотке выше, чем в плазме. При
работе с сывороткой ее как можно быстрее отделяют
от сгустка.
АЛТ, АСТ, амилаза, липаза, ЛАП, ГГТ, ХЭ устойчивы
при хранении, стабильность других ферментов
варьирует (зависит от температуры).
При хранении нельзя несколько раз замораживать и
размораживать пробы.

27. Клиническое значение и особенности исследования ферментов в лабораторной практике

28. Трансаминазы: активность в различных органах в сравнении с сывороткой крови

Орган
АСТ
АЛТ
Печень
7000
3000
Почка
3500
800
Головной мозг (кора)
8100
30
Селезенка
700
150
Миокард
8000
500
Скел. мышцы
5000
300
Поджелуд. железа
1700
600
Эритроциты
15
5
Гранулоциты
900
500

29. АЛАНИНАМИНОТРАНСФЕРАЗА (АЛТ, АлАТ, SGPT), КФ 2.6.1.2, мм~119 кДа

ЦП фермент (микросомы) + МХ, Т1/2 в сыв. ~ 50 час
Печень > почки > pancreas > сердце > мышцы > селезенка …
АЛТ = признак цитолиза:
до 5 раз
в 5 – 10 раз
более 10 раз
умеренный
средней степени
выраженный
АЛТ
в 10-50 раз
1-3 дни 2-3 нед
Острый
вирусный
гепатит
Острый
гепатит
Хронич.
гепатит
Цирроз
печени
АЛТ
АЛТ
АЛТ
20-50 сут
+ токсич. поражение ПЧ, холестаз, цирроз, шок, инф. мононуклеоз…

30. АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗА (АСТ, АсАТ, SGOT), КФ 2.6.1.1, мм~94 кДа

МХ + ЦП фермент, Т1/2 в сыв. ~ 14 час.
Миокард > печень > мышцы > почки > гол. мозг > pancreas >
селезенка > гранулоциты…
АСТ = цитолиз + глубокое поражение клеток.
АСТ > 10 раз:
- острый гепатит, некроз печени
- тяжелый синдром сдавления
- шок, тяжелая гипоксия тканей
в 2-20 раз (завис. от тяжести)
АСТ
Острый
инфаркт
миокарда
6-12
час
24-48
час
5-8
сут
АСТ в 5 – 10 раз:
- инфаркт миокарда, ТЭЛА
- травмы / хирургич. операции
- заболевания скелетн. мышц
- холестаз, хр. гепатит, опухоли
АСТ до 5 раз:
- у новорожден. – до 1,5 р. (N)
- другие болезни печени
- панкреатит
- гемолиз in vivo и in vitro
- мононуклеоз и др.

31. АМИНОТРАНСФЕРАЗЫ

Коэффициент де Ритиса = АСТ / АЛТ (норма – 1,3 0,4).
АСТ / АЛТ <1,0 :
АСТ / АЛТ >1,7 :
- острый гепатит
- шоковая печень
- рак печени
- инфаркт миокарда
- повреждение мышц
- гемолиз и др.
При гепатите С и циррозе печени АСТ / АЛТ >1,0
ПОСТЕПЕННО ТЕРЯЕТ ЗНАЧЕНИЕ…

32. АМИНОТРАНСФЕРАЗЫ: преаналитические особенности

• Гемолиз: активность АЛТ и особенно АСТ.
• Замораживание / оттаивание: не влияет на результат.
• Стабильность ферментов: при +18–23 оС – до 3-4 дней.
• Активность обоих ферментов до 1,5 раз при значительном
увеличении ИМТ (ожирении).
• Активность АЛТ / АСТ при приеме лекарств с гепатотоксическим, холестатическим и нефротоксическим действием
(пенициллины, гентамицин, эритромицин, опиаты, противотуберкулезные средства, статины, салицилаты, парацетамол и т.д.)
• Активность АЛТ и АСТ может при поражении почек.

33. АМИНОТРАНСФЕРАЗЫ: аналитические особенности

• Метод конечной точки по Райтману-Френкелю
(необходим контроль по реактивам, нелинейность, кетоны
завышают результат).
• Кинетический метод (более специфичен и точен; + Пир-5’-Ф).
Активность фермента определяется по убыли НАДН2
(скорость изменения Е340 - оптический тест Варбурга).
Лаг-фаза ! Предпочтителен старт субстратом или Пир-5’-Ф.
При очень высокой активности – повторить определение с
сывороткой, разведенной физраствором.

34.

Результаты определения активности трансаминаз разными методами несопоставимы
Метод Reitman & Frankel (1957)
АСТ – 0,028–0,125 мкмоль/с·л;
АЛТ – 0,028–0,189 мкмоль/с·л
(4-12 Ед/л)
Кинетический метод
N = 8 - 40 Ед/л

35. ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗА (ЛДГ, LDH), КФ 2.6.1.1

ЦП фермент. Участвует в гликолизе, содержится во всех тканях и
клетках = НЕСПЕЦИФИЧЕН.
Орган
ЛДГ
Печень
700
Почка
500
Головной мозг
…
Селезенка
…
Миокард
600
Скел. мышцы
700
Глад. мышцы
…
Эритроциты (ЛДГ1-2)
500
Сыворотка крови
1

36. ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗА

↑ ЛДГ – признак цитолиза, но он мало
связан с тяжестью патол. процесса.
N = 60 - 320 Ед/л;
у детей > на 10-15%.
ЛДГ :
- мегалобластная (пернициозная) анемия – корригируется вит. В12
и фолиевой к-той; ЛДГ при количества ретикулоцитов
- токсический гепатит с желтухой, острый вирусн. гепатит (< АСТ)
- канцероматоз печени и других органов
- шок, тяжелая гипоксия тканей
- острый гемолиз (гемолитический криз)
А
до 5-15 раз (ЛДГ1-2)
6-12 час 2-3 сут
Острый
инфаркт
миокарда
7-12 сут
ЛДГ1-2 -ГБДГ
(субстраты - -гидроксибутират
и -кетобутират).
Отношение ЛДГ / ГБДГ = 1,2-1,6;
при патол. печени , при ОИМ .

37. ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗА

ЛДГ :
- цирроз печени, холестаз ( до 2-3 раз)
- патология почек (у 1/3 больных - ХГ, СКВ, диабет. нефропатия)
- патология мышц (травмы, прогрессирующая миодистрофия)
- застойная сердечная недостаточность
- опухоли легких и органов брюшной полости
- хронический гемолиз (анемия), наличие искусств. клапана
ЛДГ N- :
- любой цитолиз
- хронический гепатит
- миеломы и лимфомы ( + мониторинг химиотерапии)
Опр-е ЛДГ в спинномозговой жидкости малоинформативно.
В асцитической жидкости ЛДГ при воспалительных и опухолевых процессах.

38.

ЛДГ: преаналитические и аналитические особенности
лучше в сыворотке (оксалат и ЭДТА активность до 40%);
после замораживания-оттаивания активность ЛДГ снижается.
Метод Севела-Товарека (по конечной точке, с ДНФГ).
Редоксиндикаторный метод (по конечной точке, с НТС).
Кинетический метод: ПВК + НАДН2 Лактат + НАД;
определяется прирост / убыль НАДН2 ( Е340). Результаты разные!
Изоферменты ЛДГ - электрофорез сыворотки в ПААГ
+ редоксиндикаторная реакция (или флюор.365) + денситометрия.
+
В.С. Берестовская, Е.Н. Ребякова, А.В. Козлов, 2008

39. КРЕАТИНКИНАЗА (КК, КФК, CK), КФ 2.7.3.2

ЦП (40-65%)
МХ (~15%).
Изоферменты: КК-ММ, КК-МВ, КК-ВВ.
Кофакторы: Mg2+, SH-реагенты (N-AC).
Скел. мышцы > миокард > головной мозг > гладк. мышцы >
> почки, pancreas, печень…
В сыворотке крови – КК-ММ (>95%) и КК-МВ (<5%).
КК в 20-50 и > раз (за счет КК-ММ) - при повреждениях и
заболеваниях скелетных мышц:
- рабдомиолиз (тяжелые травмы, злокачественная гипертермия
при воздействии ингаляционных анестетиков – фторотана и др.)
- прогрессирующая мышечная дистрофия (>, чем АСТ)
- полимиозит
- шок, тяжелая гипоксия мышц

40. Относительное содержание изоферментов креатинкиназы в различных органах и тканях

Орган
КК-ВВ
КК-МВ
КК-ММ
Скелетная мышца, голень
0
2-3
97-98
Скелетная мышца, дыхат.сист.
0
3-7
93-97
Миокард (норма)
0
2-3
97-98
Миокард (патологич.)
0
10-30
60-90
Легкие
70-75
0-5
20-25
Головной мозг
97-98
2-3
0
Стенка кишечника (гл. мышцы)
90-95
0
5-10
Простата
95-100
0-2
0-5
Плацента
100
0
0
Почка
75-80
0
20-25

41. КРЕАТИНКИНАЗА

КК в 5 - 20 раз:
- острый инфаркт миокарда
(спустя 4 и более часа). Ускоряется при ЧСС и аритмии,
замедляется -блокаторами.
- успешный тромболизис
- судороги, эпилепсия, миозит
- болезни ЦНС (МДП, шизофрения, нейрохирургич. операции,
травмы, сосуд. заболевания)
- гипотиреоз (декомпенсир.)
ККобщ в 5-20 раз
КК-МВ
Острый
инфаркт
миокарда
2-6 ч 14-48 ч
3-5 сут
КК до 5 раз:
- у новорожденных, в родах у матери – за счет КК-ВВ
- действие токсинов и лекарств (алкоголь, фуросемид, дигоксин,
клофибрат, фенобарбитал, преднизолон, амитриптилин …)
- опухоли простаты, мочевого пузыря, яичка, почек, грудной
железы, яичников, матки, ЦНС, заболевания крови (КК-ВВ)

42.

КРЕАТИНКИНАЗА: преаналитические особенности
КК неустойчива на свету, ингибируется цитратом и Са2+.
Предпочтительно определение в сыворотке.
Активность КК может повышаться:
- после любых хирургических вмешательств, катетеризации сердца, внутримышечных инъекций
- после дефибрилляции и массажа сердца
- при укусах пчел, ос, ожогах
- при тяжелой физической нагрузке (перегрузке, перетренировке)
- при передозировке имипрамина, амитриптиллина, барбитуратов, этилового спирта...
активности КК – при беременности (до 2 раз), после ночного
сна.

43. КРЕАТИНКИНАЗА: определение активности

♂ = 40-170 Ед/л,
♀ = 25-140 Ед/л.
КК-МВ<6% от ККобщ
Кинетический метод:
1. КрФ + АДФ (сыворотка) --> креатин + АТФ;
2. АТФ + глюкоза (гексокиназа) ---> Г-6-Ф + АДФ;
3. Гл-6-Ф + НАД(Ф) (Г-6-Ф-ДГ) ---> 6-фофоглюконат + НАД(Ф)Н2.
Активность фермента определяется по приросту НАД(Ф)·Н2
( Е340 - оптический тест Варбурга).
Изоферменты КК – электрофорез + реакция + флюор. анализ.
Активность КК-МВ – методом иммуноингибирования (добавление анти-М антител => КК-ММ угнетается полностью, КК-МВ –
наполовину). Результат В-активности умножается на 2.
Возможны ошибки !
Количество КК-МВmass – двухсайтовый иммуноанализ; N< 5 мкг/л.
Основа+АТ-1 --- МВ --- АТ-2+метка (флюор., ХЛ)

44. КРЕАТИНКИНАЗА-MB: активность или количество?

«Определение активности КК и КК-MB является приемлемой
альтернативой для оценки повреждения сердечной мышцы в
учреждениях, где недоступно определение тропонина или
массовой концентрации КК-MB. Определение общей активности КК (помимо КК-МВ) может также помочь в повышении
специфичности по отношению к сердечной мышце, когда
соотношение КК-MB и общей КК превышает предварительно
установленные референтные интервалы».
Заявление Совета по эпидемиологии и профилактике при
Американской кардиологической ассоциации (AHA) о критериях
острой коронарной болезни сердца в эпидемиологических и
клинических исследованиях (2007).

45. ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА (ALP) мм = 100 кДа; КФ 3.1.3.1

Группа мембраносвязанных ферментов (костная ткань, печень,
почки, плацента, кишечник, нейтрофилы …)
Орган / ткань
ЩФ, мкмоль/с·кг
ткани
Плацента
600
Надпочечник
500
Печень
210
Костная ткань
125
Селезенка
125
Легкое
110
Кишечник
80
Почка
71
Предстательная железа
55
Головной мозг
35
Щитовидная железа
30
Сердце
25
Bowers GN, 1975
Кофактор - Zn2+
Активаторы - Mg2+, Co2+,
Mn2+
Оптимум рН = 9 – 10.
В сыворотке крови
здорового человека –
костная и печеночная ЩФ

46. ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА

ГЕПАТОЦИТ
(желчные к-ты)
желчь
(фосфолипазы)
кровь
Физиологическое ЩФ:
- у детей в периоды активного роста (10-14 лет),
- в поздние сроки беременности,
- после физической нагрузки.
ОСТЕОБЛАСТ
(ЩФ)
ММ гидролиз
фосфатов,
облегчение их
попадания в
клетку и
минерализации

47. ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА

Костная ЩФ – >50% общей ЩФ, маркер активности остеобластов.
КЩФ - болезнь Педжета (в 10-25 раз), саркома кости, Mts в кости,
остеомаляция и рахит, заживление переломов костей, лейкоз,
гиперпаратиреоз, тиреотоксикоз…
желчной и печеночной ЩФ - холестаз (вне- и внутрипеченочный),
опухоли и Mts, цирроз ПЧ, гепатит, ЦМВ-, ВЭБ-инфекции, SR Жильбера, васкулиты, интоксикация алкоголем;
+ гепатотоксичные или вызывающие холестаз лекарства (фуросемид, фенобарбитал, циметидин…) + верапамил (через ПТГ, КЩФ)
+ ИМ и ССН, злокачественные опухоли простаты, яичка / яичника,
почки, ПЖЖ, моч. пузыря, шейки матки, легкого...

48. ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА

Кишечная и почечная ЩФ – в N экскретируются. В сыворотке при
заболеваниях кишечника (НЯК, саркоидоз), почек (ХПН), при СД…
Плацентарная ЩФ - в третьем триместре беременности и при
повреждении плаценты (поздние гестозы) + при герминативных
опухолях (семинома, дисгерминома), раке яичника…
РЕФЕРЕНТНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ, ед/л (IFCC, +37 0С):
♀: 1-12 лет - <500; >15 лет – 40-150;
♂: 1-12 лет - <500; 12-15 лет – <750;
>20 лет - 40-150;
GSCC, +37 0С:
дети >15 лет – до 644;
взрослые – 64 – 306.

49. ЩФ: преаналитические и аналитические особенности

ИНГИБИТОРЫ – Ca2+, борат, фосфат, оксалат, цитрат, ЭДТА
(связ-е Zn2+ и Mg2+).
• Сыворотка ≈ гепаринизированная плазма.
• Избегать выраженного гемолиза и липиемии.
• Замораживание / оттаивание активности ЩФ.
• ЩФ стабильна при +30 оС, медленно распадается при +37 оС.
Кинетический метод:
n-Нитрофенилфосфат (рН=9-10) ---> п-нитрофенол (желтый) +
+ фосфат, определяется прирост Е405. CV=3-6%.
Важен тип буфера:
GSCC - ДЭА 1 моль/л, рН=9,8; +25 / 37 0С,
IFCC - АМП 1 моль/л, рН=10,4; +30 0С.
При опред-и методом конечной точки нужен контроль на реактив !
Тканевые формы ЩФ определяются иммунными методами (Ostase
- костная ЩФ), химическим и термоингибированием (плацентарная
ЩФ стабильна к to и 3М мочевине, костная – ингибируется), ЭФ в
ПААГ, ИЭФ.

50. КИСЛАЯ ФОСФАТАЗА (ACP)

Группа лизосомальных ферментов, есть во всех тканях.
Очень много – в ткани простаты и в сперме.
Простатическая КФ – >50% общей КФ у мужчин. При простатите
активность не изменяется, при аденоме – повышается у части
пациентов.
КФпрост до 40-50 раз – при карциноме простаты, прорастающей
капсулу, или в фазе метастазирования.
КФпрост до 1,5-5 раз - после катетеризации мочевого пузыря,
биопсии или массажа простаты, при закупорке уретры..
КФ клеток крови (Тц, Эр, Лц), печени, (почек, костного мозга,
остеокластов) – «фоновая» активность фермента у мужчин,
общая - у женщин.
при гемолизе, массивном разрушении тромбоцитов, миеломе,
гиперпаратиреозе с остеопорозом, гемолитической и апластической анемии…
Простатическая и ТЦ КФ ингибируются 0,02 моль/л тартратом.

51.

КФ: преаналитические и
аналитические особенности
• КФ быстро инактивируется (Т½ = 1-3 ч).
Для сохранения активности КФ добавляют кислоту.
• Результаты определения тартрат-резистентной КФ
(костной) занижаются при высоком уровне билирубина.
Кинетический метод:
п-Нитрофенилфосфат (рН=4-5) ---> п-нитрофенол (желтый) +
+ фосфат; определяется прирост Е405.
При опред-и методом конечной точки нужен контроль на реактив !
N КФобщ= 0-9 Ед/л,
КФпрост = 0-3 Ед/л

52. ГАММА-ГЛУТАМИЛТРАНСПЕПТИДАЗА (GGT), КФ 2.3.2.2; мм~150 кДа

Мембраносвязанный фермент эпителиальных клеток
(желчные и почечные канальцы, ПЖЖ, кишечник …)
+ содержится в ЭПР и микросомах.
в мочу
в желчь, кровь
У мужчин –
> высокая сывороточная активность
(фермент простаты)

53. ГАММА-ГЛУТАМИЛТРАНСПЕПТИДАЗА

«Фермент холестаза»
(более чувствителен, чем ЩФ)
N = 10-105 Ед/л
ГГТ (в 10-25 раз и >):
- внепеченочный холестаз, обтурация желчных протоков
(до 140 раз), острый холангит
- алкогольное поражение печени (~ колич-ву принятого алкоголя)
ГГТ (в 5-10 раз):
- острый и хронический гепатит, цирроз печени, панкреатит
- физиологич. – у новорожденных (особенно у недоношенных)
ГГТ N- (до 5 раз):
- действие веществ, вызывающих индукцию синтеза фермента
(алкоголь, противосудорожные средства, кумарины, эстрогены)
- застойная сердечная недостаточность, вторичное поражение ПЧ

54.

ГГТ: преаналитические и
аналитические особенности
• Предпочтительно определение в сыворотке или плазме с
Li-гепарином, хотя ЭДТА и цитрат не мешают реакции.
• Умеренный гемолиз не мешает определению. Липиемия и
иктеричность нежелательны.
• Стабильность при комнатной t0 или при +40С – не менее 7 дней.
• ГГТ при приеме карбамазепина, циметидина, фуросемида,
гепарина, эстрогенов, фенобарбитала, вальпроевой кислоты
Метод конечной точки или кинетический:
-глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид + глицилглицин --->
-глутамил-глицилглицин + СО2 + п-нитроанилин (желтый)
прирост Е405

55. АЛЬФА-АМИЛАЗА (AMY), КФ 3.2.1.1

Экскреторный фермент ЖКТ.
+ обнаруживается в печени, кишечнике, почках, легких, жировой
ткани, фаллопиевых трубах, скелетной мускулатуре…
Слюнные железы S-амилаза
Поджелудочная железа P-амилаза
М.м. = 54–62 кДа
Pancreas > слюнные железы
кровь
диастаза мочи
(запаздывает на 6-9 час;
> диагностически чувствительна)

56. АЛЬФА-АМИЛАЗА

А
в 4-40 раз (P-амилаза)
Острый
панкреатит
5-8 ч
12-72 ч
2-5 сут
Активность (> 10 раз) :
- острый панкреатит (Р-амилаза)
(кроме панкреонекроза ! )
Клин. специфичность опред-я общей амилазы при о.п.= 20–60 % !,
Р-амилазы (рост в 3 раза при о.п.) - около 90%.
Активность (> 5 раз) – утечка в брюшную полость и резорбция:
-прободная язва желудка и 12-ПК, перитонит, острый холецистит,
острый аппендицит ...
- CR поджелудочной железы
- острые абдоминальные нарушения, кишечная непроходимость
- гепаторенальный синдром
- диабетический кетоацидоз (до 80% больных, в 2-5 раз)

57. АЛЬФА-АМИЛАЗА

Активность (до 3-5 раз) :
- острый паротит (сиалоаденит), другие заболевания и опухоли
слюнных желез (S-амилаза)
- фиброз и кисты ПЖЖ, обострение хронического панкреатита
(Р-амилаза), патология печени
- рак легкого и яичника, пневмонии, ХПН, травма головного мозга,
расслаивающая аневризма аорты, ожоги …
- действие глюкокортикоидов (преднизолон…)
- действие веществ, вызывающих спазм сфинктера Одди
(адреналин, морфин, фуросемид, салицилаты…)
- острая алкогольная интоксикация (до 3 раз, ~10% пациентов)
Амилаза в асцитической / плевральной жидкости :
- острый панкреатит;
- опухоли ПЖЖ / яичника / легкого;
- прободение кишечника.

58. АЛЬФА-АМИЛАЗА

Макроамилаза – комплексы фермента (чаще S-амилазы) с
IgG или IgA (м.м. > 200 кДа, длительно циркулируют в крови):
- при патологии органов брюшной полости (боли);
- часто обнаруживается случайно; активность в 2-8 раз.
- выявляется осаждением в р-ре ПЭГ 6000 (240 г/л); остаточная
активность в надосадочной жидкости - < 30%.
Амилаза в крови :
- недостаточность экзокринной функции ПЖЖ со стеаторреей,
- нефротический синдром
- у детей до 6 месяцев (особенно у новорожденных);
- после инфузии р-ра глюкозы; при высокой конц-и ТГ и ЖК.
Амилаза в моче :
- острый панкреатит - от 24 час до 7-10 дней, хотя в крови активность снижается уже через 2-5 дней;
- рак ПЖЖ, перфорация язвы 12-пк…

59. АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ

N = 25-125 Ед/л (сывор.)
10-490 Ед/л (моча)
Р-ам. = 13-53 Ед/л (~50% от общ.)
В сыворотке или гепаринзированной плазме (оксалат, ЭДТА и цитрат
ингибируют фермент, связывая Са2+); гемолиз д.б. исключен.
Фермент стабилен (> 4 дней при комнатной t0)
Результаты могут занижаться после в/в вливаний глюкозы, приема
анаболиков, при гепатитах, панкреатической недостаточности,
токсикозе беременных и при липиемии.
Метод Каравея - амилокластический. Результат зависит от t0 и от состава
крахмала => нестабильность, нестандартность…
Кинетический метод (хромогенный субстрат)
2-хлор-4-нитрофенил-мальтотриозид (синтет. субстрат СNPG3)
(амилаза) мальтозиды + 2-хлор-4-нитрофенол (желтый), по Е405.
Р-амилаза – селективное ингибирование «ненужного» S-изофермента
моноклональными антителами; далее – по конечной точке
с EPS-4-NP-G7. Ложно(+) результаты – при макроамилаземии.после
иммуноингибирования S-амилазы.

60. ЛИПАЗА (LIP), КФ 3.1.1.3, м.м.= 48 кДа

Триглицеридлипаза - экскреторный фермент ПЖЖ (+ 12-пк,
пилорус, пищевод, жировая ткань, легкие, ПЧ, ЛЦ…) Из ПЖЖ и
кишечника частично всасывается в кровь, выводится через почки.
Активируется на поверхности жировых мицелл в присутствии
желчных кислот и колипазы (белок, 11 кДа).
T1/2 липазы в плазме = 7 - 14 ч.
Макролипаза – комплекс с IgG (м.м. ~200 кДа), м.б. при
лимфомах, циррозе ПЧ постоянно увеличенная активность.
Л
до 10 раз
Острый
панкреатит
4-8 ч
~24 ч
8-14 сут
Панкреатическая липаза
(до 10 раз), в т.ч. в асцитической жидкости:
- острый панкреатит (параллельно амилазе, но более
поздняя нормализация).
Чувств.=60-100%, спец.=81-97%

61.

Динамика активности -амилазы и липазы
в крови при неосложненном панкреатите
Кратность
10
9
8
Липаза
7
6
5
-Амилаза
4
3
2
1
0
0
1
2
3
5
День
10
15
20
25

62. ЛИПАЗА: изменения активности

Панкреатическая липаза (до 2 - 5 раз) :
- перфорация язвы желудка и 12-ПК, перитонит, желчная колика
- ожирение, подагра, сахарный диабет, ОПН / ХПН
Липаза в асцитической / плевральной жидкости :
- острый панкреатит.
Панкреатическая липаза :
- туберкулез, длительные инфекции, некоторые опухоли ПЖЖ
- длительный хронический панкреатит со ↓ секреции ПЖЖ
- муковисцидоз..

63. ЛИПАЗА: преаналитические особенности

Сыворотка ≈ плазма.
Фермент стабилен (> 7 дней при комнатной t0). При нагревании и замораживани-оттаивании активность может .
Гемолиз почти не влияет на определение.
Результаты ТД-теста могут завышаться в присутствии
ревматоидного фактора (образование агрегатов)
При лечении вальпроевой кислотой и 2’,3’-дидезоксиинозином (ДДН, анти-ВИЧ) возможно развитие панкреатита и
активности липазы.
Активность липазы может после холецистографии,
введения гепарина и действия веществ, вызывающих
спазм сфинктера Одди (морфин, салицилаты).

64. ЛИПАЗА: определение активности

N = 30-190 Ед/л;
зависят от метода;
N = 8-56 мкг/л.
Кинетический турбидиметрический метод:
(избыток колипазы, желчные кислоты, Са2+)
триолеин ---> жирные кислоты + глицерин.
Эмульсия триолеина просветляется ( Е340).
Метод конечной точки:
1. 1,2-диглицерид (сыворотка)---> ЖК + моноглицерид;
2.
3.
4.
5.
Моноглицерид (МГ-липаза) ---> ЖК + глицерин;
Глицерин + АТФ (гл-киназа)--> глицерол-3-Ф + АДФ;
Гл-3-Ф + О2 (ГФ-оксидаза) --> ДОАФ + Н2О2;
Н2О2 + хромоген (пероксидаза) ---> окисленный окрашенный
хромоген (определяется Е550).
Иммунохимические методы - латекс-агглютинация, RIA, ИФА.

65. ЭЛАСТАЗА

N в сыворотке = 0,1-4,0 нг/мл
ЭЛАСТАЗА
N в кале > 200 мкг/г
Панкреатическая эластаза - экскреторный фермент ПЖЖ,
не деградирует в ЖКТ. В небольших количествах попадает
в кровь. Блокируется антипротеазами, поэтому определяют не активность, а массу фермента иммунными методами.
Панкреатическая эластазаmass в сыворотке при остром
панкреатите (параллельно амилазе и липазе, «диагностическое окно» – 3-5 дней).
Панкреатическая эластазаmass в кале более 1,5 - 2 раз
при секреторной недостаточности поджелудочной железы
(«золотой стандарт» диагностики).

66. ХОЛИНЭСТЕРАЗА

N = 7 - 19 Ед/л
ПсевдоХЭ - ЦП фермент гепатоцитов, есть в ПЖЖ, миокарде.
В норме секретируется в кровь вместе с альбумином.
Отражает синтез белка в печени (~ аналогично альбумину),
может служить показателем степени гепатодепрессии.
ХЭ :
- на 10-30% - на 10-15 сут. после инфаркта миокарда,
- на 30-50% - при вирусном гепатите (особенно хроническом),
- на 50-70% и > - при циррозе и раке ПЧ, «застойной печени»,
отравлении ФОС.
Прогрессирующее ХЭ свидетельствует о хронизации
процесса
При ХЭ противопоказаны деполяризующие миорелаксанты !

67. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

Кинетический метод :
1. Бутирилхолинйодид (сыворотка) ---> масляная кислота + холинйодид;
2. а) Холин-йодид + дитио-бис-нитробензоат ---> продукт
конденсации, определение - по Е405.
б) Масляная кислота изменяет цвет индикатора
(учет - на фотометре).

68.

«Широкое использование определения
активности ферментов … представляет
собой одно из наиболее важных
достижений лабораторной медицины».
А.В.Козлов (2005)

69.

СПАСИБО
ЗА ВНИМАНИЕ !
[email protected]

70. Глутаматдегидрогеназа (ГлДГ)

N = 0 - 4 Ед/л
МХ фермент. Печень > почки > миокард > гол. мозг > ЭР.
Активность зависит от тяжести патологического процесса.
ГлДГ в сыворотке :
- до 20-300 раз - при острой обтурационной желтхе, билиарном
циррозе и некрозах печени, остром токсическом повреждении
гепатоцитов (алкоголь, яды)
- до 2-5 раз - при вирусном гепатите, портальном циррозе ПЧ

71.

ЛЕЙЦИНАМИНОПЕПТИДАЗА
N = 15-40 Ед/л
Мембранный фермент клеток печени ( в желчь, попадает
в кровь) и почечных канальцев ( в мочу).
ЛАП в сыворотке - при гепатобилиарной патологии
(холестаз, вирусный гепатит, цирроз, застойная сердечная
недостаточность). Не реагирует на патологию костной ткани.
ЛАП в моче - при воспалительных заболеваниях почек.
Определение активности - метод конечной точки:
лейцил-4-нитроанилид ---> лейцин + п-нитроанилин (желт.)
Определяется Е405.

72. СОРБИТОЛДЕГИДРОГЕНАЗА

N = 0 - 3 Ед/л
ЦП фермент гепатоцитов, органоспецифичен для печени.
+ в небольших количествах есть в почках ( в мочу).
СДГ в сыворотке :
- до 5-20 раз - при вирусном гепатите,
- до 2-5 раз - при токсическом гепатите, циррозе и раке ПЧ,
обтурационной желтухе.
Тест менее чувствителен по сравнению с АлАТ и АсАТ.
Определение активности – кинетический метод:
фруктоза + НАДН2 (сыворотка) ---> сорбитол + НАД.
Определяется скорость снижения конц-и НАДН2 ( Е340).

73.

ТРАНСАМИДИНАЗА
N = 0 Ед/л
ЦП фермент. Почки ( в мочу) + ПЖЖ ( в кровь).
Трансамидиназа в сыворотке :
- при наличии клинических признаков панкреатита –
начинающийся или развившийся некроз клеток ПЖЖ.
- при отсутствии клинических признаков панкреатита –
поражение почек (ОПН, нефротический синдром, …)

74. АЛЬДОЛАЗА

N = 3-8 Ед/л
ЦП фермент. Скелетные мышцы > миокард > печень > …
Альдолаза в сыворотке :
- мышечная патология, включая травмы мышц
- острый инфаркт миокарда
- острый гепатит …
Уступает по чувствительности тестам АлАТ, АсАТ и КК.

75. N-АЦЕТИЛГЛЮКОЗАМИНИДАЗА (НАГ)

ЛЗС фермент, специфичен для клеток почечных канальцев
(определяется в моче). Очень чувствительный тест при
нефропатиях, превосходит креатинин и альбумин.
НАГ в моче при функциональной и органической патологии
канальцев почек (диабетическая нефропатия, нефротический
синдром, гломеруло- и пиелонефриты …)
Определение активности – метод конечной точки
Цветная реакция с продуктами расщепления N-ацетилглюкозамина.