Культивирование животных клеток

1.

Культивирование животных
клеток

2.

Введение
В промышленности животные клетки культивируют с целью получения вакцин или
белков для фармацевтического или диагностического применения, которые нельзя
получить в клетках микроорганизмов. Невозможность получения этих белков в
виде рекомбинантного продукта микробной ферментации может объясняться
несколькими причинами: структура белка стабилизируется большим количеством
дисульфидных
связей,
белок
приобретает
активность
только
после
посттрансляционных модификаций, неправильное гликозилирование приводит к
развитию иммунной реакции. В качестве примеров таких белков можно привести
терапевтические антитела, фактор VIII, эритропоэтин и тканевой активатор
плазминогена. Культивирование животных клеток с целью получения
определенного продукта - чрезвычайно трудоемкая и дорогая процедура. Поэтому
ведутся поиски альтернативных путей получения определенных белков с
использованием трансгенных животных и растений. В настоящее время ведется
активное изучение условий культивирования клеток человека с целью получения
тканей для трансплантации и тестирования действия лекарств.

3.

Культуры клеток человека
В последние десятилетия культивирование клеток человека активно применяется
для обнаружения вирусов, а также для разработки противовирусных вакцин. Клетки
определенной ткани человека, полученные от донора и размножившиеся в
питательной среде, можно заморозить и хранить в морозильных установках при -120
°С. Так создаются целые банки клеток различных тканей, как здоровых, так и
имеющих определенную патологию. После того как клетки отобрали из банка, они
сохраняют жизнеспособность в жидкой среде на протяжении около 50 циклов
деления. Затем такие «первичные» клетки необходимо поместить на твердую
питательную среду. Таким образом, процесс культивирования клеток человека для
получения определенного продукта имеет строгие ограничения. По самым
последним данным, удалось совместно культивировать клетки различных типов, что
в перспективе может привести к созданию искусственных тканей (например, кожи).
Методы «тканевой инженерии» имеют большие перспективы для своего
использования. Наибольший интерес вызывает культивирование стволовых клеток
человека, способных при созревании превращаться в любые клетки организма.

4.

Линии клеток
Для получения белков, имеющих терапевтическое значение, как правило, используют хорошо
охарактеризованные линии клеток млекопитающих. Они обладают способностью к
безграничному делению и проявляют следующие свойства:
1) короткое время генерации (20-30 ч);
2) относительно нестрогие требования к условиям культивирования
3) при этом в отличие от «первичных» клеточных культур, которые растут в суспензии, и
может быть достигнута высокая плотность культуры (это свойство позволяет
культивировать клетки в биореакторах)
4) легко трансформируются. Для производства белков в промышленности используют
клетки следующих типов: 1) гибридомные клетки применяют для получения
моноклональных антител (в основном для диагностики): 2) фибробласты клеток яичника
китайского хомячка (клетки СНО); 3) опухолевые клетки из почек сирийского хомячка
(клетки ВНК).

5.

Векторы для клонирования
Клонирование генов в животных клетках проводят с использованием специально
сконструированных векторов. ДНК этих векторов обладает способностью встраиваться в
геном хозяйской клетки и использовать имеющиеся промоторы. Обычно используют
челночные векторы, которые перед внесением в животную клетку можно оптимизировать,
например, в клетках Е. colii. В качестве селективного маркера, указывающего на наличие
вектора в геноме животной клетки, в конструкцию вводят ген, продукт которого
обезвреживает токсичные для обычных клеток вещества, например неомицин или соли
кадмия. Векторы для промышленного культивирования клеток обычно несут ген
дигидрофолзт- редуктазы: при встраивании вектора в геном клеток, не обладающих
этим ферментом (например, штамм CHO-К1), они приобретают способность расти на
среде с метотрексатом. Этот аналог фолиевой кислоты ингибирует синтез тимидина в
dhfr-отрицательных клетках. Таким образом, ауксотрофные по тимидину dhfrотрицательные клетки в результате трансфекции могут расти на минимальной среде в
присутствии метотрексата, размножаться и продуцировать белок, ген которого
клонирован в челночный вектор. Известны примеры промышленных векторов,
продуцирующих тАП и фактор VIII в клетках CHO.

6.

Пример организации лаборатории для
культивирования животных клеток

7.

Примеры часто используемых животных клеток

8.

Использование животных клеток

9.

Примеры векторов для экспрессии в клетках CHO

10.

Селективные маркеры и маркеры амплификации
векторов