Фаготерапия. Общие сведения. Биопрепараты

1.

ПРЕЗЕНТАЦИЯ
1
На тему:
Фаготерапия. Общие сведения. Выбрать любой биопрепарат.
Рассказать о составе, механизме действия, особенности
производства, способы очистки, оценки чистоты и активности.
Презентацию подготовили
студенты группы ХББО-04-20
Предущенко П.А., Давыдов
А.В.

2.

Фаготерапия вкратце:
2
— это метод лечения инфекционных заболеваний, который основан на использовании
• Фаготерапия
бактериофагов. Бактериофаги - это вирусы, которые атакуют и уничтожают бактерии. Фаготерапия может быть
использована для лечения различных бактериальных инфекций, таких как стафилококковые инфекции,
энтеробактерии, пневмококки, синегнойная палочка и др.
фаготерапии включает введение бактериофагов в организм больного с целью уничтожения
• Процедура
патогенных бактерий. Фаги могут быть применены в форме мазей, гелей, капель для глаз, слюны, аэрозолей,
назальных препаратов, инъекций.
преимущества фаготерапии включают в себя возможность применения в случае множественной
• Основные
лекарственной устойчивости и отсутствие вредного воздействия на полезную микрофлору кишечника. Однако
эффективность фаготерапии может различаться в зависимости от вида бактерий, лечебной среды и других
факторов.
• Фаготерапия также может использоваться в ветеринарии для лечения бактериальных инфекций у животных.

3.

Немного истории:
3
История фаговой терапии началась в начале 20 века, когда грузинский ученый Георгий Элиашвили и
французский ученый Феликс д'Герел впервые описали бактериофаги и их способность уничтожать бактерии.
Первые клинические испытания фаговой терапии были проведены в Грузии в 1920-х годах, где фаги
использовались для лечения инфекций кишечника, ран и других заболеваний. Однако, в то время эта терапия не
получила широкого признания за пределами Грузии.
В 1930-40 годах в Советском Союзе и других странах восточной Европы фаговая терапия стала широко
применяться для лечения различных инфекционных заболеваний, таких как дизентерия, стафилококковые
инфекции, туберкулез и др. Однако, после Второй мировой войны интерес к этому методу лечения уменьшился
из-за развития антибиотиков, которые стали широко используемыми и эффективными средствами борьбы с
инфекциями.
В последние десятилетия фаговая терапия снова привлекает внимание научного сообщества и медицинского
сообщества, особенно в связи с угрозой распространения антибиотико-резистентных бактерий. В настоящее
время проводятся исследования по разработке новых препаратов на основе бактериофагов и их применению в
клинической практике.

4.

Выбор любого препарата:
4
• Поскольку любой, то первый из списка с сайта фармакопеи (https://pharmacopoeia и тд), а именно:
Стафилококковый.
• Данный препарат относится к Монокомпонентным препаратам. Отличия между типами
следующие: монокомпонентные бактериофаги – лекарственные средства, содержащие
вирулентные фаги против одного рода или вида бактерий;- комбинированные бактериофаги –
лекарственные средства, содержащие несколько видов монокомпонентных актериофагов.
(Логично)
• Специфическая направленность препарата: Staphylococcus spp. (S. aureus)
• Состав: Активные вещества: стерильного фильтрата фаголизатов бактерий рода Staphylococcus
до 1 мл; Вспомогательные вещества: Консервант-8-гидроксихинолина сульфат - 0,0001 г/мл
(содержание расчетное); или 8-гидроксихинолина сульфата моногидрат - 0,0001 г/мл (в
пересчете на 8-гидроксихинолина сульфат, содержание расчетное). Аптека Асна
• По типу взаимодействия с бактериальной клеткой фаги подразделяются на вирулентные
(вызывающие гибель бактерий) и умеренные, которые, инфицируя бактериальную клетку,
встраиваются в ее генетический аппарат и репродуцируются в процессе деления клетки, не
вызывая ее лизис. Наш клиент относится к первому типу.

5.

Этапы работы:
5
Сборка фаговых частиц
Адсорбция бактериофагов на бактериальных
клетках
Специальные элементы фага, расположенные
на поверхности в виде фибрилл или шипов,
связываются со специфичными
поверхностными молекулами — рецепторами
на своей жертве — бактерии. Пока
бактериофаг достаточно плотно не закрепится
на поверхности бактерии, следующей стадии
не происходит. Так как существует
специальная система блокировки.
Сборка молодых фагов начинается с
упаковывания генетического материала в
икосаэдрические белковые оболочки. Далее к
фагам присоединяется хвост, на головке фага
появляются различные, необходимые для его
жизнедеятельности белки. Количество молодых
фагов внутри бактерии возрастает. Новое
поколение готовится к выходу из
бактериальной клетки.
Инъекция нуклеиновой кислоты бактериофага
внутрь клетки
После плотного прикрепления фага (адсорбции)
происходит внедрение генетического материала
бактериофага в тело бактерии. Для этого
в структуре фага природа предусмотрела наличие
специальных структур, которые действуют по типу
шприца. Именно за счет этого фаг как бы делает
инъекцию, растворяет оболочку и вводит свой
генетический материал в бактерию. Для этого
у фага есть агрессивный фермент для
прокалывания бактерии.

6.

Этапы работы 2:
Репликация копий нуклеиновой кислоты
бактериофага
Когда ДНК фага попадает в бактерию она
может раствориться ферментами
бактерии. Однако фаг защищает свою
ДНК специальными липкими белками,
которые замыкают молекулу в кольцо,
делая ее неуязвимой. Далее происходит
тиражирование генетического материала
(ДНК) фага прямо в клетке бактерии.
6
Выход зрелых фагов и смерть бактерии
Финал жизненного цикла фага —
клеточный лизис. Молодые фаги
используют для разрушения
бактериальной клетки набор ферментов,
которые расщепляют оболочки бактерий
(лизины), и белков, создающих поры во
внутренней мембране бактерии и
обеспечивающих ускорение действия
фермента лизина.
Синтез белковых и нуклеиновых частиц
После заражения бактерии начинается
перестройка клеточного метаболизма
под нужды фага: разрушаются
некоторые клеточные белки. Далее
происходит включение генетического
материала фага в метаболизм бактерии
и начинается сборка новых, молодых
фагов.

7.

Особенности производства:
Краткое описание технологического процесса
• Производственный процесс включает следующие основные этапы: работа с возбудителями
гнойно-септических и кишечных бактериальных инфекций, подбор к ним активных фаговых
рас, работа с коллекцией производственных бактериальных штаммов, регулярно пополняемых
свежевыделенными бактериями.
• Культивирование бактериофагов проводят в реакторах (ферментерах) путем посева
производственных штаммов бактерий и маточных фагов, содержащих несколько
высокоактивных фаговых рас. После завершения процесса фаголизиса для очистки
фаголизатов от фрагментов бактериальных клеток, их метаболитов, в том числе
энтеротоксинов и белковых компонентов питательной среды, культуральную суспензию
пропускают через микрофильтрационные установки. Полученный фаголизат подвергают
ультрафильтрации и концентрированию с последующей стерилизующей фильтрацией. Далее
из полученного стерильного концентрата фаголизатов готовят жидкий препарат путем
разведения 0,9 % раствором натрия хлорида со стабилизаторами или получают
лиофилизированную биомассу, предназначенную для получения таблеток (лиофилизируя
концентрат фаголизатов при соответствующих условиях).
7

8.

Способы очистки:
8
Стафилококковых бактериофагов включает в себя несколько этапов для удаления бактериальных
остатков и других примесей, чтобы обеспечить чистоту и качество продукта. Ниже представлены
основные методы очистки при производстве стафилококковых бактериофагов:
1. Ультрафильтрация: Этот метод включает использование мембранного фильтра для разделения
макромолекул и других примесей от вирусных частиц. Это позволяет удалить большие молекулы,
такие как белки и клеточные остатки, из раствора.
2. Центрифугирование: Центрифугирование позволяет разделить различные компоненты раствора
на основе их плотности. Этот метод может быть использован для удаления клеточных остатков и
других твердых примесей.
3. Хроматография: Хроматография используется для разделения различных компонентов в
растворе на основе их химических свойств. Это может быть полезным для удаления различных
примесей, в том числе белков и других загрязнений.
4. Ультрационная центрифугация: Этот метод позволяет разделить частицы в растворе на основе их
размера. Он может быть использован для удаления больших частиц и примесей, которые могут
присутствовать в процессе производства.
Комбинация этих методов позволяет обеспечить высокую степень очистки стафилококковых
бактериофагов, что существенным образом влияет на их безопасность и эффективность в
медицинских приложениях.

9.

Снова к вопросам о чистоте:
(Способы оценки чистоты)
1. Гель-фильтрация: Метод, который позволяет разделить и анализировать компоненты в образце на основе их размера
и молекулярного веса.
2. Электрофорез: Этот метод позволяет разделить и анализировать компоненты образца на основе их электрической
зарядности и молекулярного размера.
3. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ): Используется для разделения и анализа различных
компонентов в образце на основе их химических свойств.
4. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР): Позволяет идентифицировать наличие ДНК различных
микроорганизмов, что помогает исключить возможные контаминации.
5. Культура бактерий: Проведение анализа, направленного на определение наличия бактериальных примесей.
6. Испытание на концентрацию белка: Позволяет определить содержание белка в образце.
7. Методы биологической активности: Оценка специфической бактерицидной активности стафилококковых
бактериофагов.
Эти и другие аналитические методы помогают провести всестороннюю оценку чистоты препарата и удостовериться в
его соответствии стандартам качества и безопасности.
9

10.

Некоторые стандарты чистоты:
Микробиологическая чистота
• (для таблеток) должна соответствовать категории 5.2Б согласно ОФС
«Микробиологическая чистота»:
общее число непатогенных аэробных бактерий – не более 102 КОЕ в единице
препарата (1 г);
отсутствие дрожжевых и плесневых грибов в единице препарата (1 г);
отсутствие энтеробактерий в единице препарата (1 г);
отсутствие Pseudomonas aeruginosa в единице препарата (1 г);
отсутствие Staphylococcus aureus в единице препарата (1 г).
• Испытание проводят в соответствии с требованиями ОФС «Микробиологическая
чистота».
10

11.

Способы оценки активности:
Определение специфической активности бактериофагов и стабильности лизиса по методу Аппельмана
Специфическую активность бактериофагов и стабильность лизиса по методу Аппельмана определяют с
использованием гомологичных тест-штаммов бактерий (контрольных штаммов). Показатели специфической
активности указывают в фармакопейной статье. Контрольные штаммы отбирают из коллекции производственных
штаммов бактерий. Они не должны использоваться при производстве данной серии препарата. Состав питательного
бульона указывают в фармакопейной статье на определенный фаговый препарат.
Методика анализа
Испытания проводят с соблюдением правил асептики. В пробирках, содержащих по 4,5 мл питательного бульона
(МПБ, бульона Хоттингера), готовят ряд последовательных десятикратных разведений бактериофага от 10-1 до 10-6–
10-9 (в зависимости от показателей специфической активности, заложенных в фармакопейную статью на конкретный
фаговый препарат) с обязательной сменой пипеток при каждом разведении. Для приготовления первого разведения
добавляют 0,5 мл образца препарата к 4,5 мл бульона. В качестве контроля используют пробирку с 4,5 мл бульона без
фага. После этого во все пробирки с полученными разведениями бактериофага пипеткой вносят по 0,03 мл взвеси
суточной агаровой культуры бактерий, содержащей 109 микробных клеток в 1 мл по стандарту мутности (10 МЕ).
Результаты учитывают через (18 ± 1) ч инкубации при температуре (37 ± 1) °С. Возможно изменение длительности
инкубации в зависимости от видовых особенностей роста бактериальной мишени фагового препарата, о чем
указывают в фармакопейной статье. Результат определяют по отсутствию видимого роста бактерий в присутствии
бактериофага. Активность бактериофага обозначают отрицательной степенью десяти, где степень указывает
последнее разведение бактериофага, в котором рост контрольного штамма визуально не наблюдается. Для
определения стабильности лизиса срок инкубации продлевают до 2 сут.
11

12.

Другие методы:
12
• 1. Культуральные методы: Оценка активности может проводиться путем культивирования
стафилококков в лабораторных условиях и измерения их роста или выживаемости при
воздействии препарата.
• 2. Методы количественного измерения: Это может включать в себя измерение уровня
антибактериальной активности препарата на основе ингибирования роста стафилококков,
измерение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) или измерение зоны ингибиции
роста вокруг диска препарата.
• 3. Методы биохимического анализа: Использование биохимических тестов для оценки
активности препарата, например, измерение уровня специфических ферментов или
метаболических продуктов, вырабатываемых стафилококками при воздействии препарата.
• 4. Методы молекулярной биологии: Использование методов молекулярной биологии для
изучения взаимодействия препарата с генетическим материалом стафилококков, такие как
изучение изменений в экспрессии генов или восприимчивости стафилококков к препарату.
• Выбор метода оценки активности стафилококкового препарата при его производстве зависит
от конкретных целей и характеристик препарата, а также стандартов и требований,
установленных в регуляторных документах для медицинских препаратов.

13.

Список литературы
13
1. Фармакопея.РФ. 2015. https://pharmacopoeia.ru/ofs-1-7-1-0002-15-bakteriofagi-lech…. (Дата
обращения 30.11.2023)
2. Как работают бактериофаги. 2022. https://www.bacteriofag.ru/bakteriofagi/howitworks/. (Дата
обращения 30.11.2023)
3. Фаготерапия. 2023. https://www.bacteriofag.ru/bakteriofagi/howitworks/. (Дата обращения 30.11.2023)

14.

14