Транскрипция в органеллах растений

1.

Транскрипция в органеллах растений
Хлоропласты
В хлоропластах высших растений
функционируют два типа РНК-полимераз:
PEP (plastid-encoded RNA polymerase) и NEP
RPOTp (RPOT3)
у двудольных растений RPOTmp (RPOT2)
Митохондрии
В митохондриях функционируют только NEP:
РНК-полимеразы RPOT /
NEP-полимеразы (Nuclear Encoded Polymerases)
→ полимеразы фагового типа;
кодируются в ядре;
локализуются и функционируют в органеллах
RPOTm (RPOT1)
у двудольных растений
RPOTmp (RPOT2)
у мха

2.

Трансгенные линии растений арабидопсиса с измененной
экспрессией RPOTmp

3.

Функции RPOTmp в митохондриях
В митохондриях линии rpotmp по сравнению с линией Col-0 существенно снижена
активность дыхательного комплекса I и суперкомплексов I + III2 и I2 + III2
I2 + III2
I + III2
I
V
III2
F1
IV
II
Окраска в Кумасси
2D SDS-BN-PAAG

4.

Изменение экспрессии RPOTmp влияет на скорость и
чувствительность прорастания семян в стрессовых условиях

5.

Изменение экспрессии RPOTmp находится под антероградным
контролем клетки
В линиях rpotmp и fro значительно повышена
экспрессия NAC13 и NAC44.
В линиях с гиперэкспрессией RPOTmp
происходит снижение в 2-3 раза экспрессии
трех ТФ из семейства NAC:
NAC55, NAC102 и ATAF1.
Снижение уровня NAC55 наблюдается только в
линиях Col-P.

6.

Вопросы для исследования:
Поиск митохондриальных транскрипционных факторов –
эффекторов, связанных с процессами репарации и/или
рекомбинации.
(1) Выяснение возможной взаимосвязи регуляции функций
RPOTmp и репарации двухцепочечных разрывов (DSB)

7.

Вопросы для исследования:
Поиск митохондриальных транскрипционных факторов – эффекторов,
связанных с процессами репарации и/или рекомбинации:
(2) Изучение потенциальной роли белка DDbH-TRCF, гомолога бактериального TRCF
(transcription repair coupling factor) в сопряжении процессов репарации и транскрипции в
органеллах Arabidopsis thaliana
Задачи:
1. Определить внутриклеточную локализацию белка DDbH-TRCF: в трансфицированных клетках листьев Nicotiana benthamiana,
и в стабильных трансформантах Arabidopsis.
2. Изучить экспрессию DDbH-TRCF во время развития растений арабидопсиса, стабильно трансформированных геном βглюкуронидазы под контролем промотора DDbH-TRCF.
3. Проверить способность DDbH-TRCF и RPOTmp предотвращать повторную инициацию транскрипции путем количественного
определения относительного числа копий гена YdcR, расположенного на равном расстоянии между TerA и TerB.

8.

Вопросы для исследования:
(3) Изучение роли TSPO в метаболизме липидов и в развитии аутофагических явлений в раннем
развитии проростков под влиянием стрессовых условий (АБК, NaCl) на примере линий (а) с
измененной экспрессией RPOTmp и (б) с дисфункцией митохондриального комплекса I
Цель – выяснение взаимосвязи нарушений функций RPOTmp в митохондриях и хлоропластах с
экспрессией и функциями TSPO, влияющими на физиологические процессы, связанные с
метаболизмом липидов и развитием аутофагических явлений.
Задачи:
1. Определение уровня экспрессии TSPO в семенах и проростках исследуемых линий
- первое, что важно понять, связано ли повышение экспрессии TSPO именно с дисфункцией дыхательного комплекса I
в митохондриях, или же более конкретно с дефектом отсутствия RPOTmp в митохондриях.
2. Характеристика физиологических процессов в митохондриях проростков исследуемых линий.
Определение уровней дыхания, АФК, мембранного потенциала.
3. Определение уровня липидов в проростках исследуемых линий.
4. Определение уровня сахаров в проростках исследуемых линий.

9.

Методы:
Определение как исследуемые линии реагируют на воздействие агентов, вызывающих в ДНК двойные разрывы.
На фенотипическом уровне:
– наблюдение за развитием корней; определение количества мертвых клеток в корнях
– оценка способности проростков образовывать нормальные первые настоящие листья

10.

Методы:
Определение как исследуемые линии реагируют на воздействие агентов, вызывающих в ДНК двойные разрывы.
На молекулярном уровне
– анализ уровня транскрипции генов NAC44/NAC85/NAC103/MYB3R3
– детекция повреждений и анализ
Для измерения уровня накопления эктопической
рекомбинации в мтДНК и cpDNA используют
праймеры, фланкирующие повторы в мтДНК

11.

Методы:
Клонирование генов