Получение суспензионных культур

1.

Выполнил студент 3 курса, группы 20БТ-3 Евгений Андреевич Шелягович
Руководитель практики
Ирина Анатольевна Ильючик
доцент, кандидат
биологических наук

2.

Введение
Культивирование клеток и тканей растений — сравнительно молодая
отрасль биотехнологии. По технике приготовления культуры клеток
делятся на :
Однослойные — способные прикрепляться и размножаться на
поверхности лабораторной посуды;
Органные — цельные кусочки органов, сохраняющие жизнеспособность
вне организма;
Суспензионные – это культуры одиночных клеток и клеточных
агрегатов, растущие в аэрируемой жидкой питательной среде.
Представляют собой относительно гомогенную популяцию клеток,
которую легко подвергнуть воздействию химических веществ. Этот
метод применяют для культивирования клеток как растений, так и
животных(клетки крови).

3.

Направление использования клеточных
суспензий
Клеточные суспензии используют в биотехнологии для получения
вторичных метаболитов, многие из которых являются ценными
лекарственными препаратами; для промышленного выращивания
клеточной биомассы и для клеточной селекции; кроме того,
суспензии клеток используют для получения изолированных
протопластов, а также для получения новых необычных
соединений (например, камптотецина, харрингтонинаантиканцерогены; пептиды).

4.

Преимущества в сравнении с другими
методами
Клетки в суспензии имеют ряд преимуществ по
сравнению с клетками, выращиваемыми статическим
способом на агаризованной поверхности: клетки
популяции находятся в однородных условиях питания,
аэрация и удаление токсических метаболитов
клеточного окружения; у них легче проследить влияние на
рост и метаболизм различных экзогенных факторов; они
удобнее для биохимических и молекулярнобиологических исследований; на них реальнее
возможность получения стабильной клеточной популяции.

5.

Получение суспензионных культур из клеток растений
Суспензионные культуры получают из рыхлой
каллусной ткани, помещая ее в жидкую
питательную среду того же состава, что и для
каллуса, и выращивают в колбах на качалке (100120 оборотов в минуту). Суспензионную культуру
можно получать и непосредственно из первичного
экспланта (лист, стебель, корень и т. д.). Для
этого применяют ферменты, например пектиназу.
Вначале на поверхности экспланта образуется
каллусная ткань, а затем уже от нее отделяются
клетки и клеточные агрегаты, в результате чего
получается клеточная суспензия. Для некоторых
исследований культуру клеток получают путем
ферментативной
мацерации,например,
из
мезофилла листа, но такую суспензию невозможно
поддерживать в течение длительного времени.

6.

Основным способом получения суспензионных культур является культивирование
рыхлого недифференцированного каллуса в жидкой среде на качалке. При этом
каллус легко распадается на отдельные клетки и клеточные агрегаты. Рыхлый
оводненный каллус выращивают специально для этих целей на среде с
уменьшенным содержанием или даже с исключением цитокининов. Хороший
эффект на дезагрегацию каллуса оказывает также исключение из питательной
среды Са2+, поскольку вследствие этого меньше образуется пектината кальция –
основного связывающего материала растительных клеток. Пектинат кальция
можно удалить воздействуя на каллус пектиназой.

7.

Часть каллусной ткани в жидкой среде
при ее перемешивании распадается на
клетки и небольшие клеточные
агрегаты, образуя первичную
суспензию. Для избавления от крупных
плотных остатков каллуса, от больших
клеточных агрегатов ее фильтруют
через 1-2 слоя марли, нейлон либо
отбирают одиночные клетки и мелкие
агрегаты путем осаждения крупных
агрегатов при отстаивании суспензии в
течение нескольких минут. Кроме того,
долю одиночных клеток и мелких
агрегатов увеличивают частые пересевы
легких фракций суспензии.

8.

На степень диссоциации клеток оказывает влияние также состав питательной
среды, способы аэрации и перемешивания суспензии. Несмотря на все усилия,
суспензия никогда не бывает однородной, состоящей только из одиночных клеток.
В лучшем случае последние составляют 50-60 %, остальное приходится на долю
групп из 2-10 клеток и многоклеточ-ные агрегаты. В очень крупных агрегатах
наружные и внутренние слои клеток оказываются в неравноценных условиях
питания и аэрации [5].

9.

Суспензионные культуры клеток
животных(крови)
Клетки крови лучше растут в суспензионной культуре, так как в естественных
условиях они живут во взвешенном состоянии. Для перевода клеток в суспензионную культуру используют различные способы адаптации к их росту в
суспензии.
Одним из способов получения суспензионной культуры является селекция или
система отбора. Способ основан на том, что в среде клеток, растущих в монослое,
существуют клетки способные к росту в суспензии, их отбирают и в процессе
длительной селекции получают клетки, способные расти в суспензии. Так были
получены суспензионные культуры LS из L-929 и НеLа-53 из НеLа.
Другим подходом к получению суспензионных культур является адаптация клеток
к росту в суспензии. Для этого культуры интенсивно пересаживают и
культивируют в суспензии, отбирают клетки, которые адаптированы к росту в
суспензии. Однако всегда существует вероятность возврата клеток к росту в
монослое.

10.

Общая характеристика суспензионных культур
клеток животных
Как правило, клетки, отделившиеся от субстрата, на котором они
росли, неспособны к росту в суспензии и быстро деградируют. Но
если некоторые клетки культивировать во вра-щающемся флаконе
(2 об/мин), не дающем возможности прикрепления клеток к
поверхности, в среде, содержащей метилцеллюлозу,
предотвращающую агрегацию клеток, можно получить
жизнеспособные суспензионные клеточные штаммы. Иногда этого
бывает достаточно для получения суспензионной культуры, но
обычно требуются специальные сосуды для культивирования
суспензий и использование среды с дефицитом ионов кальция и
магния. Суспензионные культуры также можно получать путем
обработки отобранной для пересева монослойной клеточной
культуры 0,02 % раствором химопсина в фосфатно-солевом
буфере или 0,1 % трипсином и 0,01 % ЭДТА с последующим
длительным периодом адаптации, сопро-вождающимся
различными манипуляциями, предотвращающими возврат к
монослою.

11.

В заключении хочется отметить, что эта тема является очень перспективной для
фармацевтической промышленности, так как продуктивность культуры тканей
можно регулировать, а значит количество необходимого соединения будет
гарантировано. Кроме того культуры защищены от внешних неблагоприятных
факторов, способных снизить качество сырья. Процесс сбора и обработки такого
сырья значительно упрощается за счёт культивирования только нужной ткани
растения в стерильных условиях. Проблемой является трудоёмкий процесс отбора
необходимой ткани и разработки среды для получения оптимального результата.

12.

Суспензионные культуры лучше растут внутри ограниченного
диапазона концентраций клеток и в том случае, когда сосуд
наполнен средой наполовину. Для обеспечения этих условий
необходимо каждый день или (в случае медленно растущих
культур) через день, удалять половину суспензии через боковое
горлышко и добавлять равный объем свежей среды. Некоторые
клетки (трансформированные и кроветворные клетки, асцитные
опухоли) способны расти как на субстрате, так и в суспензии в
зависимости от солевого состава среды культивирования.
Культуры лимфоцитов не обнаруживают тенденции к адгезии к
поверхности стекла или пластика и выживают на дне
культивационного сосуда под тонким слоем среды.
Суспензионное культивирование первичных и перевиваемых
клеточных линий проводят в роллерных установках, где
создаются благоприятные для клеток условия постоянного
перемешивания жидкой и газовой фаз, общий объем среды при
этом снижается вдвое по сравнению со стационарными
условиями [1].

13.

Получение суспензионной культуры
микроорганизмов
Для приготовления суспензии используют суточную
бульонную или агаровую культуру исследуемых
микроорганизмов. Для получения бульонной культуры
отбирают одну или несколько четко изолированных
колоний, легким прикосновением петли к центру колонии
переносят незначительное количество материала в
пробирку с 4-5 мл жидкой неселективной среды, например
МПБ. Инкубируют при 37 °С.
Для приготовления суспензии из агаровых культур можно
использовать только четко изолированные колонии,
выросшие на неселективных питательных средах.

14.

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ

15.

Список литературы
1.
Блажевич О.В. Культивирование клеток. Курс лекций/Мн.: БГУ, 2004. — 78 с
2.
Биотехнология растений: культура клеток. М. : Агропромиздат, 1989. 280 с. Бутенко, Р.Г. Биология клеток
высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: учеб. пособие / Р.Г. Бутенко. М. : ФБК–ПРЕСС,
1999. 160 с.
3.
Бутенко Р.Г. Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. 280 с.
4.
Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного
происхождения. М.: 1996. с.3-20.
5.
Валиханова, Г.Ж. Биотехнология растений / Г.Ж. Валиханова. Алматы : «Конжык», 1996. 272 с.
6.
Войнов Н. А. Современные проблемы и методы биотехнологии: электрон. учеб. пособие / Н. А. Войнов, Т.
Г. Волова, Н. В. Зобова и др. ; под науч. ред. Т. Г. Воловой. – Красноярск: ИПК СФУ, 2009.