Карты генов наследственных заболеваний

1. Лекция 7 ПРОЕКТ «ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА». КАРТЫ ГЕНОВ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

2.

3.

В. Н. СОЙФЕР
Университет им. Джорджа Мейсона,
Фэйрфакс,
Виргиния, США
_Не нужно быть беспочвенным
оптимистом, чтобы верить, что
через пятьдесят лет
"биологический код" - химическая
зашифровка наследственных
свойств - будет расшифрован и
прочитан.
С этого момента человек станет
полным властелином живой
материи...
В.А. Энгельгардт. <Комсомольская
правда>,
9 июня 1957 года

4.

Глубокий интерес к исследованиям
наследственности человека и общий прогресс
генетики создали предпосылки для
осуществления в последнем десятилетии 20
века грандиозного научного международного
проекта по секвенированию генома человека
(определение последовательности нуклеотидов
в молекуле ДНК), в реализации которого
приняли участие 20 исследовательских групп из
США, Великобритании, Японии, Франции,
Германии и Китая.

5.

Расшифровка последовательностей нуклеотидов
в ДНК всех хромосом и митохондрий, так
называемого «чернового» варианта генома
человека была завершена к середине 2000 года;
материалы этого проекта были опубликованы в
феврале 2001 года в 2-х журналах “Nature” и
“Science”, и были получены независимо друг от
друга международным консорциумом «Проект
«Геном человека»» и «Celera», для которой
сиквенс генома человека являлся коммерческим
предприятием.
В апреле 2003 года был получен окончательный
вариант всей последовательности гигантской
(3,3х109 пар нуклеотидов) молекулы ДНК.

6.

7.

8.

ЧТО ТАКОЕ "ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА"?
Цель проекта - выяснить последовательности азотистых
оснований и положения генов (картирование) в каждой
молекуле ДНК каждой клетки человека, что открыло бы
причины наследственных заболеваний и пути к их
лечению.
В проекте заняты тысячи специалистов со всего мира:
биологов, химиков, математиков, физиков и техников. Это
один из самых дорогих научных проектов в истории. В 1990
г. на него потрачено 60 млн. долл., в 1991 г. - 135 млн., в
1992-1995 гг. - от 165 до 187 млн. в год , а в 1996-1998 гг.
только США израсходовали 200, 225 и 253 млн.
Интерес к уже полученным результатам огромен: самые
цитируемые в 1998 г. авторы (не только в генетике или
биологии, но во всех областях науки) Марк Адамс и Крэйг
Вентер из Института исследований генома в штате
Мэриленд (США) - частной компании, занимающейся
только составлением "генных карт".

9. При проведении программы «Геном человека» были определены три основные цели этой программы:

1) создание точной
генетической карты
человека;
2) создание физической
карты генома человека;
3) сиквенс всего генома
человека.

10.

1) Точная генетическая карта генома человека
создавалась при выполнении двух условий:
выявлении в геноме человека большого
количества полиморфных генетических
маркеров и наличия достаточного количества
семей для анализа сцепления между этими
маркерами и установления их взаимного
расположения.

11.

Генетические маркеры необходимо было
локализовать на генетической карте, установив
их взаимное расположение. Это стало
возможным благодаря тому, что картирование
ДНК-полиморфных маркеров было проведено
большинством исследователей на одной
выборке семей. Это выборка включала 61
многопоколенную семью с большим числом
членов в каждой семье, отобранных в
исторических провинциях Франции Центром по
изучению полиморфизма у человека (Centre
d’Etude du Polomorhisme Humain – CEPH).

12.

Все исследователи, которые занимались картированием ДНК-
полиморфизмов, могли получить ДНК от членов этой семьи.
Как только первые ДНК-маркеры были картированы по всем
хромосомам, работа по маркированию новых стала быстро
ускоряться, так как их надо было просто встроить в уже
имевшуюся карту для каждой хромосомы.
В очень короткий срок удалось создать генетическую карту для
всего генома, в которой расстояние между ближайшими ДНКмаркерами не превышало в среднем 5сМ. Были созданы
коммерческие наборы для определения 300 и более ДНКполиморфизмов в геноме, которые позволили провести так
называемый геномный скрининг и относительно легко
картировать гены наследственных болезней.
Кроме того, столь плотно заполненная маркерами
генетическая карта позволила уменьшить количественные
требования к семейному материалу, пригодному для изучения
сцепления генов.

13.

Многочисленные ДНК-полиморфизмы,
обладающие высокой информативной
ценностью, позволили в ряде случаев
использовать для картирования генов
наследственных болезней такой феномен, как
неравновесие по сцеплению.
Генетические маркеры, обнаруживающие
сцепление с генами наследственных болезней,
встречаются в семьях с такой же частотой, как и
в популяции, и инструментом для анализа
сцепления является их сегрегация, зависимая
или независимая от гена наследственного
заболевания в конкретной семье.

14.

В некоторых случаях, когда мутация в гене
наследственного заболевания возникла
относительно недавно и определенный
аллель полиморфного генетического
маркера очень тесно сцеплен с геном
наследственного заболевания и находится с
ним в фазе притяжения, это будет
проявляться в том, что ген наследственного
заболевания и какой-то аллель
полиморфного генетического маркера будут
встречаться всегда вместе.

15.

Неравновесие по сцеплению между разными ДНКмаркерами и генами наследственных болезней
найдено при муковисцидозе, хорее Гентингтона,
ФКУ, миотонической дистрофии и некоторых
других наследственных болезнях.

16. 2) С целью создания физической карты генома, клонированные сегменты генома человека необходимо было маркировать.

•Это было сделано с помощью коротких сиквенсов в 100-200
п.н. концов фрагментов, так называемых STS (sequence tagged
sitеs), хромосомная локализация которых точно известна. STS
легко идентифицируются с помощью ПЦР. Получено более 50
000 STS, разбросанных по геному, и во время физического
картирования, когда устанавливается взаимное
расположение ДНК фрагментов из геномных библиотек, эти
STS используют как маркеры перекрывающихся сегментов
ДНК. Из перекрывающихся сегментов ДНК, которые до этого
могли быть клонированы в составе бактериальных, фаговых
или дрожжевых искусственных хромосом, можно построить
достаточно протяженные отрезки ДНК, которые называют
контигами, из которых можно построить физическую карту
хромосому.

17.

Физическая карта человеческого генома имеет клональную основу,
которая была разработана еще в 1981 году Олсоном.
Суть метода заключается в том, что геном, то есть нить ДНК,
разрезается на сегменты, содержащие по 150 тысяч пар н. с
помощью частичного переваривания сайтспецифическими
эндонуклеазами.
Эти большие сегменты ДНК помещали в искусственные
бактериальные хромосомы (ВАС) и вводили в бактерии, где они
копировались при каждом делении бактерии.
В результате образовывались клоны идентичных молекул ДНК и
таких клонов, перекрывающих геном человека, должно быть около
20 тысяч.
Каждый клон переваривался рестрикционной эндонуклеазой, в
результате чего проводилось сравнение паттернов сайтов
рестрикции, что дало возможность установить их взаимное
расположение и выстроить по порядку.
В результате получилась физическая карта генома.

18.

3) Следующим этапом исследования явилось разрезание
отдельных ВАС-клонов на фрагменты и их клонирование.
Полученные в результате клонирования фрагментов субклоны,
секвенировали.
•Каждый раз секвенировали большое число одинаковых
субклонов, чтобы быть уверенными в том, что каждый фрагмент
оригинального ВАС-клона проанализирован несколько раз (как
правило, 8-10 раз) и при этом не допущено ошибок.
•Сиквенсы отдельных фрагментов объединяли с тем, чтобы
получить последовательность нуклеотидов в каждом исходном
ВАС-клоне.
•И наконец, сиквенс всего генома собирали путем соединения
сиквенсов набора набора ВАС, перекрывающих весь геном.
•Созданная таким образом карта сиквенса генома человека
включает последовательности нуклеотидов, содержащие в
среднем несколько млн. пар н. в длину.
•Для этого использовали метод ПЦР.

19.

•Результаты секвенирования показали, что геном человека содержит
от 30 до 40 тысяч генов, а не 70-100 тысяч, как это было принято
считать ранее. Гены человека являются более комплексными по
сравнению с генами других изученных организмов.
•Так, проект «Геном человека» выявил менее 20 тысяч генов, среди
которых идентифицировано 740 генов для РНК, которая не кодирует
белки, но возможно, что таких генов будет значительно больше, так
как у дрожжей кодирующих генов – 6 тысяч, у дрозофилы – 13 тысяч, у
растений – 26 тысяч.
•У человека число синтезируемых белковых продуктов, очевидно, в
1,5-2 раза больше числа генов.
•Плотность генов в человеческом геноме существенно ниже, чем у
других видов: на 106 пар н. у дрожжей – 483 гена, у червя – 197, у
дрозофиллы –117, а в 21 хромосоме человека плотность генов
составляет 7, в хромосоме 16 – 16, а в среднем по всем хромосомам – 12.
•Следует отметить, что только 94 из 1278 семейств белков в геноме
человека свойственны позвоночным, основное отличие заключается в
сложности организации белков человека, которая проявляется
большим числом доменов на белок, а также их новыми комбинациями.
•С этого времени понятие «геном человека» перестал быть
абстрактным понятием.

20.

Как показали результаты программы «Геном человека»,
наиболее общей формой наследственной изменчивости
является однонуклеотидный полиморфизм, то есть
различия в определенном участке генома между двумя
людьми на один нуклеотид.
Согласно экспериментальным данным и расчетам проекта
«Геном человека» при сравнении одинаковых участков
генома у двух людей на протяжении 1000-2000 пар
нуклеотидов, имеются различия по нуклеотидному составу
на одну единицу.
Это значит, что нуклеотидные последовательности всех
людей совпадают на 99,9%, и всего лишь 0,1% отличий
достаточно, чтобы создалось существенное разнообразие
человечества. Если сравнить два различных генома живых
объектов, то можно сделать вывод о том, что у человека и
бактерий одинаковы более 600 генов, а геном мыши и
человека совпадает на 90%, геномы человека и шимпанзе
различаются на 1% нуклеотидных последовательностей

21.

В общем секвенировано и собрано с помощью
компьютерных программ в протяженные
участки более 90% эухроматиновых районов
генома, но полностью законченным можно
считать сиквенс около 15 тыс. генов и, вместе
с тем, несмотря на неполноту сиквенса,
полученные результаты уже сейчас
представляют интерес и могут
использоваться для выявления генов
предрасположенности к частым
заболеваниям.

22.

Только 1-1,1% всего секвенированного генома
составляют последовательности, кодирующие
белки.
Это 5% из 28% сиквенса последовательностей
нуклеотидов, которые транскрибируются в РНК.
Более 50% ДНК представлено повторяющимися
последовательностями разных типов: 45% в 4
классах паразитических элементов ДНК,
возникших из транспозонов (длинные
вставочные элементы – LINE, короткие
вставочные элементы – SINE),
3% в повторах, состоящих из нескольких
нуклеотидов, и
5% в недавних дупликациях больших сегментов
ДНК, происходящих из разных частей генома.

23.

По-видимому, большинство повторов
представляет собой паразитические,
самодостаточные элементы ДНК, то есть
способные самовоспроизводиться, которые
используют геном человека как удобного
хозяина.
У человека все паразитические повторы ДНК
кажутся старыми, практически нет
доказательства продолжающихся реинсерций.
Поэтому они могут быть использованы для
анализа эволюционной истории генома.

24.

Одним из наиболее важных разделов
программы «Геном человека» является
обнаружение генов в секвенированных
последовательностях генома.
Положение многих генов определено путем
соотнесения сиквенсов мРНК с геномным
сиквенсом, для остальных генов
локализацию устанавливают с помощью
специальных компьютерных программ.
Просексенировано 11 174 полноразмерных
мРНК, относящихся к 10 742 генам (2,4%
генов дают множественный сплайсинг).

25.

•Вместе с тем, несмотря на подробные представления о
структуре генома человека, изложенные в литературе, следует
сказать, что основная работа по его расшифровке еще впереди,
так как секвенирование генома позволило закончить только
структурный анализ генома, но медицине уже сегодня нужна
функциональная геномика.
•Предполагают, что сиквенс будет завершен в течение
относительно короткого времени.
•Особое внимание будет обращено не только на создание более
совершенных компьютерных программ идентификации генов,
но и их регуляторных областей.
•На основе сиквенса генома человека будет создан каталог
генетических вариаций у человека. И, наконец, в широких
масштабах начнется работа по функциональной геномике, где на
первое место выйдут изучение активности генов и их
взаимодействия с другими генами, определяющими
формирование различных ферментопатий.

26.

ЧТО БУДЕТ СДЕЛАНО ПОСЛЕ ЗАВЕРШЕНИЯ
АНАЛИЗА ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА?
• Главная стратегическая задача будущего
сформулирована следующим образом: изучить
однонуклеотидные вариации ДНК в разных органах и
клетках отдельных индивидуумов и выявить различия
между индивидуумами.
• Анализ таких вариаций даст возможность не только
подойти к созданию индивидуальных генных портретов
людей, что, в частности, даст возможность лучше
лечить болезни, но и определить различия между
популяциями, выявлять географические районы
повышенного риска, что поможет давать четкие
рекомендации о необходимости очистки территорий от
загрязнения и выявлять производства, на которых есть
большая опасность поражения геномов персонала.

27.

• Эта грандиозная задача рождает не одни радужные ожидания
всеобщего блага, но и вполне осознанную тревогу юристов и
борцов за индивидуальные права человека.
• Так, в частности, высказываются возражения против
распространения персональной информации без разрешения тех,
кого она касается.
• Один пример помогает понять эти тревоги: уже сейчас страховые
компании нацелились на добывание таких сведений правдами и
неправдами, они намереваются использовать данные против тех,
кого они страхуют.
• Например, если подающий на страховку несет потенциально
болезнетворный ген, компании не хотят страховать таких людей
вовсе или же пытаются заломить бешеные суммы за их страховки.
Исходя из этого, Конгресс США уже принял ряд законов,
направленных на строгий запрет распространения генетической
информации относительно отдельных людей, а юристы всего мира
интенсивно работают в данном направлении.

28.

ЗАДАЧИ НА БУДУЩЕЕ
С учетом постоянного наращивания темпов работ руководители
проекта заявили в конце 1998 г., что проект будет выполнен гораздо
раньше, чем планировалось, и сформулировали задачи на
ближайшую перспективу:
2001 г. - предварительный анализ генома человека;
2002 г. - расшифровка генома плодовой мухи Drosophila
melanogaster;
2003 г. - создание полных карт генома человека;
2005 г. - расшифровка генома мыши с использованием методов сДНК
и искусственных хромосом дрожжей.
Помимо этих целей, официально включенных в международный
проект, поддерживаемый США и рядом других стран на
правительственном уровне, некоторые исследовательские центры
объявили о задачах, которые будут решаться в основном за счет
грантов и пожертвований. Так, ученые Калифорнийского
университета (Беркли), Орегонского университета и Центра Ф.
Хатчинсона по исследованию рака начали расшифровку генома
собаки.

29.

КАРТЫ ГЕНОВ НАСЛЕДСТВЕННЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ

30.

Результатом общественного проекта «Геном
человека» явилось создание карт наследственных
заболеваний человека.
В настоящее время картировано более 1,5 тыс.
генов наследственных заболеваний (всего к концу
февраля 2002 года картировано почти 7800 генов
человека).
Более точные сведения можно получить из Online
Mendelian Inheritance In Man (OMIM).
Картирование генов наследственных болезней,
которое до недавнего времени, было, последним
шагом в генетическом анализе, теперь стало
отправной точкой на пути к идентификации гена.

31.

Если у лиц с наследственным заболеванием выявляют
делеции в одном и том же месте одной и той же
хромосомы, то это почти всегда указывает на то, что
ген наследственной болезни локализован в том районе
хромосомы, который отсутствует во всех делециях,
независимо от их размера.
Таким образом были картированы гены нескольких
наследственных болезней: гены ретинобластомы,
синдрома Прадера-Вилли, Ангельмана.
Использование делеций для локализации генов
называется методом делеционного картирования.

32.

Сходным образом для установления локализации гена
наследственной болезни могут использоваться сбалансированные
транслокации, когда у носителя такой транслокации диагностируют
наследственное заболевание.
Это позволяет предполагать, что один из разрывов хромосомы,
предшествующий возникновению транслокации, нарушил
структуру гена, локализованного в месте разрыва: миопатия
Дюшена (ген локализован в хромосоме Х и обычно проявляется
тяжелой миопатией у мальчиков).
Вместе с тем обнаружили несколько случаев типичной клинической
картины миопатии у женщин, они оказались связанными с
транслокациями между хромосомой Х и аутосомами, причем в
хромосоме Х разрыв всегда локализован в районе Хp21, что
значительно сократило время поиска гена миопатии Дюшена.
Кроме транслокации у пораженных женщин должна также
наблюдаться преимущественная инактивация нормальной
хромосомы Х.

33.

Картирование гена возможно также с помощью
дупликации – суперксиддисмутазы, которая была
картирована на хромосоме 21, так как ее уровень
постоянно повышен у больных с синдромом
Дауна.
В таблице представлены картированные гены
наследственных болезней человека: (1) –
картирован нормальный ген, (2) – картирован
ген заболевания, (3) – картирован и нормальный
ген и ген заболевания, в гене найдены мутации,
(?) – данные по картированию следует считать
предварительными.

34.

ЛИТЕРАТУРА
1. Кнорре Д.Г. Биохимия нуклеиновых кислот // Соросовский
Образовательный Журнал. - 1996. - Т. 3. - С. 11-16; 1998. - №8. - С. 30-35.
2. Сойфер В.Н. Репарация генетических повреждений // Там же. 1997. Т. 8. С. 4-13.
3. Лещинская И.Б. Генетическая инженерия // Там же. 1996. - Т. 1. - С. 32-39.