Иммунологические реакции

1.

Тема лекции:
Имунологические реакции.
Реакции AG-AC в vitro

2.

Иммунологический (иммунобиологический)
метод
Серологические реакции ( in vitro )
Выявление антигенов
микроорганизмов:
в пат. м-ле
(экспрессдиагностика)
в чистой
культуре
(серол.
идентификация)
Выявление
антител в
сыворотке
больного
(серодиагностика)
Кожноаллергическ
ие пробы:
выявление
специфической
гиперчувствительности
(аллергии)
Методы
оценки
иммунного
статуса

3.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Иммунологические методы используют, как для
выявления титра антител в сыворотке крови
(серодиагностика), так и для обнаружения антигенов в
биологических жидкостях.
Общие закономерности иммунологических методов (ИМ):
• Исследование производится in vitro;
• Проявляются при иммунологическом соответствии
(гомологичности) антигена и антитела;
• Протекают в 2 фазы (невидимая и видимая).
• Для количественной характеристики иммунологических
методов исследования используют такие понятия, как
чувствительность и специфичность.
• В идеале чувствительность и специфичность
иммунологических методов приближается к 100%.

4.

Реакции антиген-антитело в vitro
Реакция Aг-Aт опрелеляется специфическим взаимодействием
между эпитопами Аг и паратопами Ат.
В данном процессе проявляются
4 типа связей:
• водородные связи,
• электростатические связи,
• силы Van der Waals,
• гидрофобные связи.
Связь Aг-Aт обладает тремя
характеристиками:
• бывает экзотермической,
• специфической
• обратимой.

5.

Иммунологические реакции
• Обнаружение в сыворотке крови больного антител к
возбудителю инфекции или соответствующего антигена
позволяет установить причину заболевания.
• Свойство веществ к интесивному реагированию (Avidite)
одного Aт к другому специфичному Aг характеризует с
какой скоростью проявляется реакция Aг-Aт
(появление осадка, агглютинация и т.д.).

6.

Данная реакция зависит от:
• постоянной асоциации,
• валентности Aт,
• количества эпитопов,
• температуры,
• pH,
• ионной силы среды.
Важно:
один паратоп может скомбинирваться только с одним эпитопом,
называемым “специфичный”.
Таким образом, если известен хотя бы один из элементов
реакции - Aг или Aт, может быть определён другой.

7.

• Сродство одного Aт к другому специфичному Aг
характеризует интенсивность межсвязовых сил в
комплексе Aг-Aт. Она зависит от стерической
комплиментарности между паротопом и эпитопом.

8.

Реакции Aг-Aт (серологические реакции)
имеют два практических пути к применению:
I. Сероидентификация:
Определение и дозирование Aг (неизвестный элемент выделенные микробные штаммы из определенных проб)
посредством известных специфичных Aт.
Возможны два источника Aт: Aт моноклонные,
абсолютно однородные, которые распознают
всего лишь один эпитоп и Aт поликолнные,
которые содержатся в имуных сыворотках
(антисыворотки), которые предполагают связи с
высокой захватываемостью (авидностью) с Aг.

9.

Имуные сыворотки получяются после введения(инекции)
лабораторному животному определеного известного Аг.
После определенного периода сыворотка полученая от
данного животного будет содержать антитела против данного Аг.
Но точная природа полученного Aт из данной сыворотки не
известна в полном объеме (это поликлональные Aт).
Специфичность данной антисыворотки должно постояно
проверяться при этом нежелательные Aт должны
абсорбироваться.

10.

II. Серодиагностика:
Определение и титрование Aт из сыворотки болного
(неизвестный компонент) по отношению к определенному
специфичному Aг (определенного после установки
диагноза).
Некоторые реакции Aг-Aт проявляются напрямую и могут
быть замечены исследователем:
к примеру:
• выпадение осадка или агглютинация комплексов
Aг-Aт,
• дезинтеграция (лизис) некоторых несуших клеток Aг на их
мембране (гемолиз, бактериолиз, и т.д.).

11.

• Другие реакции Aг-Aт не проявляются “спонтанно” in vitro.
• В данном случае прибегают к искуственным процедурам,
таким как применение “меченным” Aт:
• Флюорохромом - меченные Aт: имунофлюоросценция.
• Радиоактвно-изотопно-меченные Aт:
радио-имунный анализ.
• Ферментно- меченные Aт :
имунноферментный анализ.

12.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕНАНТИТЕЛО
I.
Специфическая фаза:
имеет место взаимодействие между Aг и соответствующим
специфичным Aт. Это быстротекущий феномен, невидимый,
общий для всех реакций Aг-Aт.
Протекает при температуре в 37 C, в присутствии электролита
(физиологический р-р).
II. Неспецифическая фаза:
видимая для реакции Aг-Aт, проявляется посредством
выпадения осадка, агглютинации, дезинтеграции и др. явлений,
зависящих от определенных условий (валентность Ac, размеров
Ag, и т.д.).

13.

Реакция агглютинации
из латыни – agglutinatio – склеивание
• Реакции агглютинации — это простые реакции
склеивания корпускулярных антигенов с помощью
антител.
• Различают:
— прямые реакции агглютинации, которые используют для
выявления антител в сыворотке крови больного.
Добавление взвеси убитых микробов к сыворотке больного
вызывает образование хлопьевидного осадка
(положительная реакция склеивания микробов антителами).

14.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ
• Реакция Aг-Aт может проявляться посредством
агглютинации тогда, когда антигенные детерминанты
проводяться фигурными частицами (нерастворимые,
корпускулярные Aг), при этом специфичные Aт являются
полноценными (по крайней мере бивалентные).
• Аглютинация определена формированием некоторой
рещетки между Aг и Aт, что позволит приблизить
достаточное количество фигурных частиц для получения
видимой не вооруженным глазом агглютинации.
Aт IgM с 10 эпитопами потенциально агглютирует более
эфективно чем Aт IgG.

15.

Классификация реакций агглютинации
1.
“Активная” агглютинация, в которой фигурная частица
(корпускулярная Aг) непосредственно является
носителем специфичных антигенных детерминантов
(эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, спериатозоиды,
бактерии)
2.
“Пасивная” агглютинация, в которой частица является
основой для закрепления на ней растворимого
антигенного детерминанта, который закрепляется на её
поверхности. Чаще всего в качестве основы
используются формалиновые эретроциты, частицы из
латекса или холестироловые кристалы.

16.

Активная (непосредственная)реакция
агглютинации
• Качестенный аспект
Реакция может быть проведена на предметном стекле или в
пробирках.
Реакция на предметном стекле
Перемешиваются капля сыворотки и капля антигенной
суспензии в капле физ. раствора (электролит).
Наблюдение проводится под микроскопом или
невооруженным глазом.
В случае положительной реакции появляются аглютинаты, а
жидкость становится позрачной;
• О Аг соматический, термостабильные– мелкозернистый
осадок
• H Аг жгутиковый, термолабильные – рыхлые, крупные
хлопья
• В случае отрицательной реакции препарат остается мутным.

17.

18.

Реакция аглютинации в пробирках
Для определения Ат в сыворотке крови больного. В ряде
пробирок производят серийное разведение сыворотки к
которой добавляют диагностикум (взвесь убитых м/о или
частицы с сорбированными Аг).
Позитивная реакция проявляется посредством образования
осадка в виде перевернутого зонтика на дне пробирки (через
20-24 часа) и осветления жидкости. Оценка интенсивности
реакции проводится по системе 4 плюсов (++++).
Неаглютинированнные клетки оседают на дне пробирки в
виде кнопки или кольца (негативная реакция). Изучение
проводится невооруженным глазом или с помощью вогнутого
зеркала микроскопа.

19.

• Количественный аспект
Метод последовательных разбавлений
Первоначально осуществляются последовательные
разведения сыворотки (1/50, 1/100, 1/200) в которую
вводятся впоследствии в равных количествах Aг.
Далее термостат – 2 часа и при комнатной температуре 1820 часов.
Оценка:
самое большое разведение сыворотки в которой
проявляется агглютинация по меньшей мере 3 “+” (+++)
называется титр антител агглютирования (титр
агглютированой сыворотки).
• Прямое агглютирование применяется при определении
группы крови или при диагностике инфекционных
болезней (сероидентификация Aг или выявление и
титрование Aт из сыворотки больного) .

20.

• Реакции пассивной агглютинации
(непрямые)
реакция агглютирования
• Пасивная агглютинация предпологает расположение
одного растворимого Aг (или одного Aт) на инертную
корпускулярную основу, которая не восприимчева к
реакции Aг-Aт. В качестве инертной основы могут
служить:
эритроциты,
латексные частицы,
кристалы холестерола.
• Суспензия обогащенная с Aг или с Aт частиц вступает в
контакт с имунной сывороткой (соответстенно с Aг), по
аналогии случая непосредстенного агглютирования.
• Плюсы косвенных реакций: простота в наблюдении и
высокая чувствительность.

21.

• Косвенная (пасивная) реакция
гемаглютинации – РHГА / PПГА
• Некоторые антигены полисахарного происхождения
присоединяются спонтанно на поверхности эритроцитов,
после короткого срока инкубации. Белковые присоединяются
лишь после предварительной подготовки эритроцитов (к пр.:
обработка танином, формол).
• РHГА проводят в лунке полиэстеровой пластины.
• Позитивная реакция проявляется посредством агглютинации
чувствительных эритроцитов (перевернутый зонтик
коричневого цвета на дне лунки).

22.

23.

24.

Реакция аглютинации
— реакция торможения гемагглютинации основана на
способности антител иммунной сыворотки нейтрализовать
вирусы, которые в результате теряют свойство склеивать
эритроциты. Используется для диагностики вирусных
болезней;

25.

Реакция латекс-агглютинации (РЛА)
• Носители антигенов или антител - частицы полистирольного
латекса, которые служат носителями антигена и при
образовании иммунных агрегатов играют роль “мостиков”
между молекулами антител.
• Латексные частицы являются как бы искусственными
эритроцитами, но более устойчивы к внешним воздействиям.

26.

• Реакция латексной агглютинации используется для
идентификации ревматоидного фактора у больных, у
которых есть подозрение на ревматоидный полиартрит, в
бактериологии для быстрой идентификации м/o или их Aг
в анализе, или идентификация изолированных штаммов,
также для серодиагностике некоторых инфекций.

27.

Реакции преципитации
• Имуно - осаждение проявляется лишь в том случае когда
растворимый Aг смешиваемся с соответствующим Aт.
• Реакцию можно наблюдать в жидкой фазе или твердой и
носит или качественный, или количественный характер.
• Это специфичные реакции с низкой чувствительностью,
требующие значительного количества антител.
• Осаждение результирующих молекулярных комплексов из
связей Aг-Aт будет представлять трехмерную решетку из
Aг объединенных посредством Aт.

28.

Условия образования решетки
преципитации:
• Aт должен быть по крайней мере бивалентнным (Aт парные)
• Aг – многовалентнный (хаптены не могут выпадать в
осадок)
• Максимальное осаждение соответствует зоне
эквивалентности, в которой Aт и Aг обладают оптимальным
соотношением по концентрации, что позволяет осаждение
всех молекул Aт с соответствующими Aг.
При избытке Aг или Aт осадка не будет.
• Применение:
в мед. практике (видовая принадлежность различных белков:
кровь, сперма и т.д.), в пищевой гигиене (определение
пищевого фальсификата), при диагностике инфекционных
заболеваний и т.д.

29.

ОСАЖДЕНИЕ В ЖИДКОЙ СРЕДЕ
• Реакция кольцевой преципитации
В пробирке диаметром в 5 миллиметров вводят иммунную
сыворотку; пробирка наклоняется и на её стенки медленно
вводится раствор Aг, чтобы не перемешался с сывороткой.
Если Aт из сыворотки соответствует Aг, в отдельных зонах двух
жидкостей образуется белое кольцо, которое означает
осаждение комплекса Aг-Aт.
Преимущество метода – быстрота и простота.
Практическое применение:
Идентификация пятен крови,
Обнаружение фальсификации пищевых продуктов,
Обнаружение полисахаридного антигена агента
Сибирской язвы (реакция Ascoli).

30.

• Реакция флокуляции (по технике Ramon)
Проводится последовательное разбавление иммунной
сыворотки (Aт) к которой добавляются равные доли Aг.
Образцы помещаются в термостат и периодически
проверяются, чтобы выявить пробирку в которой появится
первичный осадок (зона экивалентности).
Применение: для определения количества токсинов,
антитоксинов, анатоксинов.

31.

Преципитация в твердой фазе (в геле)
• В данных реакциях Aг и Aт дифузируют один по
направлению к другому, перемешиваются посредством геля
и в зоне оптимальной концентрации этих двух реактивов
появляется осадок в виде бело-серых полос.
• Если в реакции присутствуют несколько комплексов Aг-Aт,
проявиться ряд линий осаждения.
• Может использоваться для качественного анализа состава
Aг в каком-то растворе.

32.

Двойная иммунодиффузия
(техники Ouchterlony и Elek)
Стеклянная пластинка покрывается агаром или наливается
агар в чашку Petri.
• В технике Ouchterlony Aг и Aт диффундируют из лунок
расположенных на расстоянии 15 mm один от другого.
• В технике Elek 2 реактива диффундируют с поверхности
бумажных полос расположенных на поверхности агара.
• Молекулы диффундируют в гель в зависимости от их массы и
образует линии осаждения для системы Aг-Aт,
соответствующие в зоне равновесия.
• Если 2 Aг идентичны, их линии объединяются, но если они
разные – отдаляются
• Применение – обнаружение токсинов (токсигенез),
антитоксин, белковые Aг

33.

34.

35.

36.

• Контраммунноэлектрофорез (CIEF)
Полезна при исследовании комплексных антигенных
растворах. Изучение возможно после 90 минут.
Агар залит на стеклянную пластину, Aг и Aт представлены в
циркулярных резервуарах по 2 mm в диаметре, на
расстоянии в 10 mm.
Во время электрофореза Aг, заряженный отрицательно,
мигрирует к позитивному полюсу, встречая Aт которые
мигрируют к катоду.
В взаимодействии гомогенных Aг и Aт имеет место
образование линии осажденияare.
CIEF необходим для исследования компонентов Aг в
биологических жидкостях: LCR, моча, плевральная
жидкость и т.д.

37.

38.

39.

• Реакция COOMBS
Некоторые Ac (моновалентные) не аглютинируют в
нормальных условиях (пр.: антитела анти-Rh,
ответственные за плодо-материнскую несовместимость в
системе Rh).
Они могут быть выявлены благодаря тестам Coombs.
Возможны 2 техники, в зависимости от способа отбора проб:
кровь у новорожденого или у беременной женщины.

40.

- По основной технике Coombs.
- У новорожденного определяется наличие анти-Rh материнских
Aт закрепленных на эритроцитах, если мама является Rh-.
- К этим подозрительным эритроцитам добавляется человеческая
сыворотка анти-Ig.
- Это сыворотка не будет аглютинировать с нормальными
эритроцитами, а даже наоборот, вызывает аглютинирование
эритроцитов на которых закреплены анти-Rh Ac

41.

- Непрямая техника Coombs.
- У беременной женщины с Rh- , анти-Rh Aт присутствуют
в сыворотке.
- Изначально к данной сыворотке добавляются эритроциты
Rh+ (для формирования комплекса Aг-Aт), далее
применяется сывороткаapoi анти-Ig.

42.

Реакция нейтрализации
• Реакция нейтрализации основана на способности антител
иммунной сыворотки нейтрализовать повреждающее
действие микроорганизмов или их токсинов на
чувствительные клетки или ткани.
• При отсутствии повреждающего эффекта смеси антител и
микробов или их токсинов на культуру клеток говорят о
специфичности взаимодействия комплекса антигенантитело

43.

Серологические реакции с использованием
меченных Aт
В некоторых случаях невозможно обнаружить реакцию AгAт: некоторые Aт не осаждаются, другие и не осаждаются и
не аглютинируют, существуют комплексы Aг-Aт которые не
фиксируют C.
Для таких случаев могут использоваться меченные Aт, что
позволить распознать соответствующий Aг.
Комбинирование Aт с меченными не влияет на их
иммунологические свойства.
Данные реакции проводятся на жестких поверхностях
(лезвия, пластические пластины)

44.

Наиболее часто Используемые маркеры:
- Флорохромы (родамин, флуоресцеин), которые излучают
красно-оранжевый или зелено-желтый свет при попадании в
UV излучение (Иммунно-флюорисцентная реакция)
- Ферменты (щелочная фосфатаза, пероксидаза),
предрасположенные изменить цвет подложки (substrat)
(Иммунно-ферментная реакция)
- Радио-изотопы (125J sau 3H), которые соответственно
излучают гамма и бета лучи (Радио – иммунный анализ)

45.

• Реакция иммунофлюоресценции
(RIF, reacţia COONS)
Прямой метод (только с целью сероидентификации).
Из материала, содержащего Aг (чистая культура, тканевая
биопсия) готовится мазок, на который применяют
специфическую иммунную сыворотку с Aт
маркированный флюорохромом .
Через 20 мин инкубации во влажной камере препарат
изучается под люминесцентным микроскопом.
В случае позитивной реакции обнаруживается местная
люминесценции.
Недостаток – потребность в иммунной сыворотке
маркированной специфично для каждой Aг.

46.

• positive test for rabies
• negative test for rabies

47.

• Непрямой метод.
Используется для сероидентификации и серодиагностики.
На мазок с Aг наносят соответствующие немеченные Aт.
Через 20 мин тщательно вымывается препарат, далее
добавляется anti-Ig флорисцент, который комбинируется с Aт
из этого комплекса.
Данный реактив может использоватся неоднократно.
Anti-Ig получены иммунизацией кроликов (или других
животных) посредством Ig.

48.

49.

Реакция с использованием меченых
антител или антигенов
Используют также ферменты, разлагающие не только
хромогенный, но и люмогенный субстрат.
В этом случае при положительной реакции появляется
свечение.
Подобно иммунофлюоресценции иммуноферментный
метод применяют для обнаружения антигенов в клетках
или титрования антител.

50.

• Техника основанная на фиксации:
Флуоресцентный маркер- антикомплементная сыворотка,
которая будет связана с комплементом фиксированном на
комплексе Aг-Aт.
• RIF используется для быстрой идентификации Aг из
биосубстрата или для серодиагностики .

51.

Реакция с использованием меченых
антител или антигенов
В иммуноферментном анализе вместо
флюорохромов иммунную сыворотку можно метить
ферментом (пероксидазой хрена или щелочной
фосфатазой).
Реакцию оценивают по окрашиванию раствора в
желто-коричневый (пероксидаза) или желто-зеленый
(фосфотаза) цвет.

52.

• Иммуноферментная реакция (RIE, ELISA –
Enzyme Linked Immunosorbent Assay).
Прямая RIE (метод sandwich).
- Используемая лишь в сероиндентификации Aг.
- В лунки из полиэстеровых пластинок в которых фиксированы
Aт ( известные Aт) наливается раствор с неизвестными Aг.
- Инкубируется 1час.
- После тщательного промывания добавляются
Aт маркированные ферментами Aт, которые фиксируются
на свободные эпитопы поливалентного Aг.
- После 30 мин-1ч инкубации, лунки снова моются. Наличие
комплекса Aт-Aг-Aт-маркированного обнаруживается с
помощью хромогенного субстрата (вначале бесцветное
вещество,но которое красится под действием фермента,
ex. Перекись водорода и ортофенилэндимин).

53.

54.

- RIE непрямая.
- Применяется лишь при серодиагностики Aт.
В лунках на полистероловой поверхности в которых
зафиксированы известные Aг наливается раствор
неизвестного Aт.
- Далее 1час инкубации.
- После тщательной промывки лунок добавляю меченные
ферментами лиганды, (анти-Ig ) которые фиксируются на
Aт.
- После инкубации в 30 мин-1час сново промываются лунки.
- Присутствие меченного комплекса Aг-Aт-Aт определяется
при помощи хромогенного субстрата (бесцветное
вещество, которое меняет цвет под воздействием фермента,
пр. перекись водорода и орто-фенилендиамин ).

55.

56.

57.

ELFA (Enzyme-Linked Fluorescent
Assay)
• Более чувствительная и быстрая чем ELISA
• Фермент (щелочная фосфатаза), конъюгированная с
антителами разлагает субстрат (MUP – 4-метил
умбелиферил фосфат) с образованием флуоресцентного
соединения (метил умбелиферил), которое может быть
обнаружено с помощью спектрофлуориметра

58.

Иммуноблоттинг
• применяют для выявления антител к отдельным антигенам
или «узнавания» антигенов по известным сывороткам.
Метод состоит из 3 этапов:
- разделения биологических макромолекул (например, вируса)
на отдельные белки с помощью электрофореза в
полиакриламидном геле
- переноса разделенных белков из геля на твердую подложку
(блот) путем наложения пластины полиакриламидного геля на
активированную бумагу или нитроцеллюлозу
(электроблоттинг

59.

Иммуноблоттинг
- выявления на подложке искомых белков с помощью прямой
или непрямой иммуноферментной реакции.
Как диагностический метод иммуноблоттинг используют
при ВИЧ-инфекции. Диагностическую ценность имеет
обнаружение антител к одному из белков внешней оболочки
вируса.

60.

61.

62.

Иммунологические методы
• Преимущества:
методы экспресс-диагностики, позволяющие определить
антигены возбудителей в течение нескольких минут или
часов.
• Недостатки:
- Несмотря на гибель бактерий после проводимой
этиотропной терапии, антигены возбудителей могут
персистировать в организме от 3 до 4 недель и выявляться
данными методами

63.

Недостатки:
- Существует широкое антигенное родство между родами и
видами внутри каждого семейства бактерий и даже среди
различных семейств. Это может привести к получению
ложноположительных результатов
- Определение антигенов бактерий не позволяет установить
чувствительность возбудителей к антибиотикам, что также
снижает значимость этих методов.

64.

Недостатки:
- Серологические реакции имеют лишь относительную
достоверность, так как могут быть неспецифическими или
положительными у лиц, перенесших соответствующую
инфекцию в прошлом (анамнестическая реакция), а также у
получивших профилактические прививки (прививочная
реакция).

65.

Молекулярно-генетическая диагностика
Возможности :
- качественный скрининг
- количественный анализ ( вирусная нагрузка)
- типирование
- прогноз заболевания
- терапевтический мониторинг

66.

Молекулярно-генетические методы
исследований
Среди большого многообразия гибридных методов
молекулярный анализ нуклеиновых кислот ( МАНК ) –
синоним ПЦР наиболее широко используется в
микробиологической диагностике.
В основе метода ПЦР лежит природный процесс комплементарное достраивание ДНК матрицы,
осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.
Эта реакция носит название репликации ДНК.

67.

Молекулярно-генетическая
диагностика
Естественная репликация ДНК включает в себя
несколько стадий:
• Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали,
расхождение нитей ДНК);
• Образование коротких двухцепочечных участков ДНК
(затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК);
• Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание
обеих нитей)

68.

Спасибо за внимание!