Исследование выраженности активации микроглии и нейротрофических изменений по уровню BDNF у мышей

1.

МАОУ «Лицей № 22 «Надежда Сибири»
Исследование выраженности активации микроглии и
нейротрофических изменений по уровню BDNF во фронтальной коре и
гиппокампе у мышей при паркинсоноподобном состоянии, вызванном
нейротоксичностью МФТП
Выполнила: Михайлова Дарья
Научный руководитель: д. б. н.
Амстиславская Тамара Геннадьевна
лаборатория трансляционной
Биопсихиатрии НИИФФМ

2.

https://www.nhs.uk/conditions/parkinsons-disease/tre
Проблематика
https://www.thelancet.com/journals/laneur/article/PIIS1474-4422(06)703
• В настоящее время нет лекарства от болезни Паркинсона, только методы лечения,
помогающие облегчить симптомы и поддерживать качество жизни.
• Немоторные симптомы часто плохо распознаются и неадекватно лечатся.
• Нейроанатомические и нейрохимические причины большей части немоторного
симптомокомплекса при болезни Паркинсона неизвестны.
Цель
• Изучение нейроморфологических изменений в головном мозге мышей в рамках
нейротоксической модели БП вызванных системным введением МФТП в рамках
фармакологической модели.

3.

Цель:
Цели объединить и сделать отдельно с проблематикой
Выяение когнитивных нарушений, вызванных системным введением МФТП в
модели БП у мышей, и их нейроморфологических коррелятов в ЦНС.

4.

Задачи
1) Изучить показатель нейрональной плотности;
2) Оценить уровень экспрессии тирозингидроксилазы
в нигростриарной системе;
3) Оценить уровень экспрессии микроглиального маркера IBA1
4) Оценить уровень экспрессии нейротрофического фактора BDNF

5.

1) оценить когнитивные функции в тестах на рабочую и пространственную па
паркинсоноподобном состоянии, вызванном
нейротоксичностью МФТП;
2) оценить когнитивные функции в тестах на обучение у мышей C57Bl/6 при
состоянии, вызванном
нейротоксичностью МФТП;

6.

Что такое болезнь Паркинсона?
- это медленно прогрессирующее хроническое нейродегенеративное
неврологическое заболевание, которое поражает дофаминергические
нейроны в черной субстанции.
Дофамин
Черная субстанция

7.

Моторные симптомы
Немоторные симптомы
• Брадикинезия
(замедление движений )
• Вокалические симптомы
• Нарушение походки
• Ригидность
• Постуральная
нестабильность
(неспособность
поддерживать равновесие в
динамических и статических
условиях)
• Дистония
(стабильные сокращения групп
мышц)
Симптомы
болезни
Паркинсона
• Психические/Поведенческие
расстройства:
o Галлюцинации
o Психоз
o Депрессия
o Проблем с памятью и концентрацией
o Нарушения сна
• Потливость
• Проблемы с желудочно-кишечным
трактом
• Боли
• Нарушение обоняния
• Нарушение сердечного ритма

8.

Дофаминергические пути и память
Черная субстанция
Вентральная
область покрышки
Мезокортикальный
Нигростриарный
Пути, связанные с
системами
вознаграждения
Мезолимбический
Тубероинфундибулярный

9.

Что из себя представляет память
Память - это психический процесс, который заключается в запечатлении,
сохранении и последующем узнавании и воспроизведении следов прошлого
опыта, позволяющие накапливать информацию, не теряя при этом прежних
знаний, умений, навыков.
+виды памяти
+механизмы памяти

10.

Молекулярные механизмы
Дисфункциональные
системы клиренса
белков
Ингибирование
комплекса I
Митохондриальная
дисфункция
Недостаток энергии
↑Уровень свободных
радикалов
Окислительный
стресс
Активация микроглии
(иммунных клеток)
Неправильный
фолдинг и агрегация
α-синуклеина
Альфа-синуклеин-индуцированное
Нейровоспаление
нейровоспаление
Дегенерация и гибель дофаминергических нейронов
Болезнь Паркинсона

11.

Операционализация понятий
Микроглия —
резидентные макрофаги
центральной нервной
системы (ЦНС).
Нейровоспаление —
патологический процесс
в структуре нервной
ткани, заключающийся
в активации иммунного
ответа с помощью
астро- и микроглии.
Признаки нейровосполения:
• активация макрофагов
(микроглии)
• повышение цитокинов и
хемокинов
• активация иммунных клеток
• локальное повреждение
тканей

12.

Деактивированная
Активированная
Белковые маркеры:
Белковые
маркеры:
P2Y12, CD115,
CD11b, CX3CR1,
CD68, IBA-1
P2Y121↓, CD1151↑,
CD11b1↑,CX3CR1, CD681↑,
IBA1↑
Функции:
Регулирование нейронной
активности, синаптической
пластичности, поддержание
гомеостаза мозга
(Формирование памяти
гомеостатическая)
Функции:
Повышенная выработка
цитокинов, миграция
периферических иммунных
клеток, уничтожение патогена,
очистка от мусора,
восстановление тканей
(Иммунная)
Woodburn, S. C., Bollinger, J. L., & Wohleb, E. S. The semantics of microglia activation: neuroinflammation, homeostasis, and stress.
Маркеры активации:
MHC II, CD16,
CD32,CD40, CD86,
CD163,CD206

13.

МФТП
1-метил-4-фенил-1,2,3,6тетрагидропиридин
Астроцит
МАО Б
ДАТ
МФП+
Синаптичсекая везикула
Гематоэнцефалический
барьер
АФК

14.

Синтез дофамина

15.

Методы исследования:
1) Поведенческое тестирование;
Тесты и их фотки

16.

Объект, предмет исследования:
Объект исследования: половозрелые самцы мышей инбредной линии
C57Bl/6 в возрасте 2,5-3 мес. весом 25-30 г.
*фото
Предмет исследования: эффекты нейротоксина МФТП в отношении
когнитивной функции (обучения, разных видов памяти), а также ключевых
процессов развития БП (нейродегенеративных изменений в нигростриарной
системе, фронтальной коре и гиппокампе; активации микроглии и
экспрессии нейротрофического фактора BDNF в мозге) у мышей в рамках
фармакологической модели БП, вызванной системным введением МФТП.

17.

Дизайн эксперимента Лизы
Опыт по анализу формирования следа
памяти о страхе с использованием
теста УРПИ включал три этапа:
ознакомление с экспериментальной
установкой;
выработка УРПИ через 24 часа после
ознакомления;
проверка обучения - тестирование
через 24 часа после выработки.
Предподготовка

18.

Дизайн эксперимента
Внутрибрюшинное
Анестезия Прямая перфузия
сердца
введение
МФТП/NaCl
12 день
Извлечение
мозга
Нарезка
мозга
Забор биообразцов
Погружение мозга в раствор
20%-ной сахарозы на ночь
Микроскопия

19.

Дизайн эксперимента
Материалы и методы
Половозрелые самцы мышей инбредной линии
C57BL/6 в возрасте 2,5-3 мес., весом 25-30 г
Контрольная группа
«NaCl»
Экспериментальная
группа
«МФТП_1х»
Внутрибрюшинное
введение МФТП
однократно
в дозе 30 мг/кг
Экспериментальная группа
«МФТП_4х»
Внутрибрюшинное введение
4-кратно в дозе 20 мг/кг в
течение дня с интервалом в
2 часа
Внутрибрюшинное
введение
растворителя
(0,9% раствор NaCl)

20.

Внутрибрюшинная
инъекция
Перфузия
Jihane Soueid, Amaly Nokkari, and Joelle Makoukji.
Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Chapter 15: Techniques and Methods of Animal Brain Surgery
Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques

21.

Извлечение мозга

22.

Криосрезы (30 мкм) были получены при помощи
криотома HistoSafe MicroCut – SADV (Китай) и окрашены
Исследуемый показатель
Нейрональная плотность
Экспрессия тирозингидроксилазы
Экспрессия микроглиального маркера IBA1
Экспрессия нейротрофического фактора BDNF
Метод
окраски
Окраска по
Нисслю
Окраска с
помощью
специфичных
антител

23.

Микроскопия
Обработка данных
Статистический
анализ
Микрофотографии срезов - микроскоп Axioplan 2 (Carl Zeiss) с
индукцией флуоресценции, либо светового микроскопа
Eclipse Ci-L с камерой DS-Fi2 (Nikon, Япония)
Результаты были обработаны в программе для оцифровки
микроскопических изображений Image Pro Plus Software 6.0
(Media Cybernetics, MD, USA)
Статистический анализ данных осуществляли с помощью
программы STATISTICA for WINDOWS методами дисперсионного
анализа, t-критерия Стьюдента.

24.

Результаты

25.

Рисунок 1 – Оценка когнитивной функции по показателю памяти и обучения в тесте условной реакции пассивного
избегания у мышей линии C57Bl/6, подвергшихся нейротоксическому действию МФТП

26.

Рисунок 2 – Оценка когнитивной функции по показателю рабочей памяти (проценту правильного выбора рукава в протоколе
спонтанной альтерации) в тесте Т-образного лабиринта у мышей линии C57Bl/6, подвергшихся нейротоксическому действию
МФТП

27.

Рисунок 3 – Оценка когнитивной функции по показателям эпизодической памяти и обучения (латентное
время захода в укрытие в течение 4-х забегов в первый день обучения, А) и долговременной памяти и
обучения (сравнение латентного времени захода в укрытие в первых забегах в течение 1-4 дня обучения, Б)
в тесте Барнс у мышей линии C57Bl/6, подвергшихся нейротоксическому действию МФТП

28.

Нейрональная плотность
СА1 область гиппокампа
Контроль
М ФТП
Контроль
М ФТП
Фронтальная кора

29.

Экспрессия тирозингидроксилазы
Черная субстанция
Контроль
М ФТП
Контроль
М ФТП
Стриатум

30.

Экспрессия микроглиального маркера
IBA1
СА1 область гиппокампа
Контроль
М ФТП
Контроль
М ФТП
Фронтальная кора

31.

Экспрессия нейротрофического фактора BDNF
СА1 область гиппокампа
Контроль
М ФТП
Черная субстанция
Контроль
М ФТП

32.

Выводы

33.

Активация микроглии
Повышению уровня экспрессии
микроглиального маркера IBA1
Активация иммунной функции
Снижение экспрессии
нейротрофического
фактора BDNF
Деактивация гомеостатической
функции и функции, связанной
с формированием памяти

34.

Системное (внутрибрюшинное) введение нейротоксина МФТП мышам
для моделирования паркинсоноподобного состояния вызывает
ослабление консолидации следа памяти о страхе, тогда как показатели
рабочей и пространственной памяти существенно не затрагиваются.
В схему

35.

36.

37.

Количество людей с болезнью
Паркинсона
Болезнь Паркинсона
поражает 1-2 человека на
1000 населения.
Dorsey, E. R., Sherer, T., Okun, M. S., & Bloem, B. R. (2018). The Emerging Evidence of the Parkinson
Pandemic. Journal of Parkinson's disease, 8(s1), S3–S8. https://doi.org/10.3233/JPD-181474
Tysnes, Ole-Bjørn; Storstein, Anette (2017). Epidemiology of
Parkinson’s disease. Journal of Neural Transmission, (), –
. doi:10.1007/s00702-017-1686-y

38.

Базальные ганглии

39.

40.

Сделать поэтапную схему
Неправильный фолдинг и агрегация α-синуклеина
Нейровосполения
Митохондриальная дисфункция (Дефицит комплекса I/ гены, вызывающие
наследственную
БП,
играют роль в митохондриальном гомеостазе/α-синуклеин
влияет
на функцию митохондрий)
Дисфункциональные системы клиренса белков
Окислительный стресс
Молекулярные механизмы

41.

В
исследовании
нейротоксина
установлено,
МФТП
паркинсоноподобного
мышам
состояния
что
системное
введение
для
моделирования
вызывает
когнитивные
нарушения, а именно ослабление консолидации следа памяти о
страхе, тогда как показатели рабочей и пространственной памяти
существенно не затрагиваются. Эффекты МФТП на когнитивную
функцию ассоциированы с усилением активации микроглии,
ослаблением
нейротрофической
функции
и
снижением
плотности нейронов во фронтальной коре и гиппокампе мышей,
подвергшихся системному воздействию МФТП, по сравнению с
контролем.

42.

Проблема ранней диагностики
Немоторные симптомы появляются гораздео
раньше
Даже если есть подозренеи на немоторный
сиптом как на побочку Паркинсона – врач
ничего сделать не может, полностью станет
ясно только после появления моторных
проявлений
Все молекулярные механизмы – непонятны
Нет механизмов – нет лечения, только маскировка симптомов
Какие области поражаются, как это происходит
Мысли