Изучение влияния различных факторов на активность Na+-K+-АТФазы

1.

Изучение влияния различных факторов
на активность Na+-K+-АТФазы
Выполнили:
Ковалева Ксения
Кузнецова Дарья
Преподаватели:
Букач О. В.
Климанова Е. А.

2.

Теоретическое введение
• Na+/K+-АТФаза – фермент, катализирующий
транспорт ионов Na+ и K+ через плазматическую
мембрану животных клеток. На каждую
гидролизованную молекулу АТФ транспортируется
три иона Na+ из клетки и два иона K+ внутрь клетки,
поэтому работа данного фермента – ключевой
процесс в поддержании трансмембранного
потенциала.
Na+/K+-АТФаза состоит из двух субъединиц:
большой каталитической субъединицы α и малой
субъединицы – β. Каталитическая субъединица
образует значительное число трансмембранных αспиралей.

3.

Материалы и методы
Для нашего исследования фермент выделялся и медуллярного
слоя почек кролика. Полученные фракции микросом были
разделены на аликвоты по 500 мкл и заморожены до
использования.
Были приготовлены все необходимые реактивы для определения
концентрации смеси белков по методу Лоури и по определению
содержания фосфата по методу Ратбуна-Бетлах.
Также был приготовлен и заморожен раствор АТР для
последующего определения активности фермента.

4.

Определение концентрации смеси белков из
фракции микросом по методу Лоури
D
D
0,8
0,8
y = 0,0117x
R² = 0,9909
0,7
0,6
0,6
0,5
0,5
0,4
0,4
0,3
0,3
0,2
0,2
0,1
0,1
0
0
0
y = 0,0116x
R² = 0,9701
0,7
10
20
30
40
Сбелка = 43,4 мг/мл
50
60
70
0
Содержание белка, мкг
10
20
30
Сбелка = 29 мг/мл
40
50
60
70
Содержание белка, мкг

5.

Определение содержания фосфата
Активность фермента измерялась по количеству
образованного им фосфата в единицу времени.
Для определения содержания фосфата использовался
метод Ратбуна-Бетлах: этот метод основан на измерении
оптической плотности растворов при длине волны 660 нм.
Растворы содержат окрашенное комплексное соединение,
образующееся из неорганического фосфата в присутствии
соединений молибдена и хлорида олова в ацетатном буфере.

6.

Определение содержания фосфата
по методу Ратбуна-Бетлах
D
D
1,4
1,6
y = 0,0131x
R² = 0,9981
1,2
1,4
y = 0,0134x
R² = 0,9968
1,2
1
1
0,8
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0
0
0
20
40
60
80
100
120
Содержание белка, мкг
0
20
40
60
80
100
120
Содержание белка, мкг

7.

Определение активности фермента
В полученных микросомах, помимо Na+K+-АТФазы содержались и другие
ферменты, гидролизующие АТФ с
образованием неорганического
фосфата.
Поэтому, чтобы определить активность
конкретного исследуемого фермента,
мы добавляли его специфический
ингибитор — уабаин, проводя таким
образом ингибиторный анализ.

8.

Определение активности фермента
Для проведения ингибиторного анализа мы ставили две пробы с уабаином, две
пробы без уабаина, а также контроль.
Инкубацию фермента с раствором АТФ проводили в течении 5 минут при
температуре 37°С.
В случае контроля фермент добавляли строго после инкубации.
Далее содержание фосфата в пробах мы определяли спектрофотометрически,
используя полученную ранее калибровку по фосфату.

9.

Результаты и
обсуждения

10.

I. Влияние детергента на активность
фермента в микросомах
70
45
41
60
50
40
После инкубации с
детергентом
30
Без инкубации с
детергентом
20
10
0
16
Активность Na-K-АТФазы, мкмоль Pi/(час*мг
белка)
Активность Na-K-АТФазы, мкмоль Pi/(час*мг
белка)
62
40
35
30
25
20
15
10
5
0
23
После инкубации с
детергентом
Без инкубации с
детергентом

11.

II. Активность фермента в разных
тканях
18
25
23
14
12
В медуллярном слое
почек
11
10
В слизистой желудка
8
6
4
2
0
5
В
саркоплазматическом
ретикулуме
Активность Na-K-АТФазы, мкмоль Pi/(час*мг
белка)
Активность Na-K-АТФазы, мкмоль Pi/(час*мг
белка)
16
16
20
В медуллярном слое
почек
14
15
В слизистой желудка
10
В
саркоплазматическом
ретикулуме
5
1
0

12.

III. Влияние низких концентраций
уабаина на активность фермента
30
57
50
50
40
После инкубации
с уабаином
После инкубации
без уабаина
Без инкубации
30
20
10
0
16
Активность Na-K-АТФазы, мкмоль Pi/(час*мг
белка)
Активность Na-K-АТФазы, мкмоль Pi/(час*мг
белка)
60
26
25
24
23
20
15
10
5
0
После инкубации с
уабаином
После инкубации
без уабаина
Без инкубации

13.

Выводы
Были выделены микросомы, содержащие Na+-K+-АТФазу, из
наружного медуллярного слоя почек кролика.
Концентрация белка в них составила 43,4 и 29 мг/мл.
Активность АТФазы в полученных микросомах составила 16 и 23
мкмоль Pi/мг белка/час.
После инкубации в детергенте активность фермента в микросомах
увеличивается.
+ +
В разных тканях содержание Na -K -АТФазы различное,
наибольшая активность наблюдается в медуллярной зоне почек.
Уабаин в низких концентрациях увеличивает активность фермента.

14.

Спасибо за
внимание!

15.

Список литературы
1. Rathbun WB, Betlach MV. Estimation of enzymically produced
orthophosphate in the presence of cysteine and adenosine triphosphate.
Anal Biochem. 1969 Apr
2. Robert B. Gennis. Biomembranes, molecular structure and function. 1997