Исследование статьи Proteomic

1.

Исследование статьи
Proteomic and Bioinformatics Analyses of Mouse Liver
Microsomes
Fang Peng, Xianquan Zhan, Mao-Yu Li, Fan Fang, Guoqing
Li, Cui Li, Peng-Fei Zhang, and Zhuchu Chen
2012
Докладчик: студентка 4 курса гр. 09-01
специальность биоинженерия и биоинформатика
Михайловская Анастасия Игоревна

2.

Цели и задачи
Цель: систематически идентифицировать белковые компоненты
микросом печени, провести функциональную аннотацию с
биоинформационным анализом и дать представление о
биологических функциях печени.
Задачи: преодолеть низкую эффективность разделения
мембранных белков.

3.

Схема эксперимента

4.

Методы
● центрифугирование
● центрифугирование в градиенте сахарозы
● электрофорез в полиакриламидном геле, двумерный и
одномерный

5.

Центрифугирование
Реактивы: измельченная и обескровленная печень (примерно 10г),
охлажденная среда для гомогенизации (0,25 М сахароза, рН 7,4)
гомогенизация I
гомогенизация
II
TAMATO
центрифугирование
I
HITACHI
центрифугирование
II
Beckman Instruments
центрифугирование
III
Beckman Instruments
t
5-10 минут
30-60 секунд
10 минут
I 30 минут
II 30 минут
I 30 минут
II 1 час
RCF
RPM
перемешивали
вручную
1,000 rpm × 3
1,500 rpm × 3
1,000g
I 3,000g
II 8,000g
I 34,000g
II 130,000g
Результат: получение “легких” микросом

6.

Центрифугирование в градиенте сахарозы
Реактивы: розовый осадок от
предыдущего центрифугирования,
52% сахароза-0.1 M H3PO4 бафер (pH
7.1), плотность сахарозы доводили
до 43,7%. Фракцию помещали в одну
пробирку, последовательно
накладывали 7 мл, 5 мл, 5 мл и 6 мл
38,7%, 36,0%, 33,0% и 29,0% сахарозы.
Ротор type 70i.
Результат: получение “тяжелых”
микросом

7.

Центрифугирование в градиенте CsCl
Реактивы: “легкие” и “тяжелые”
микросомы, 0.25 M сахароза (pH
7.0), 0,25 М сахарозы, содержащей
CsCl, с конечной концентрацией
0,015 М.
Результат: получение чистых
микросом

8.

Двумерный электрофорез
Реактивы: микросомные белки (400мкг), регидратационный раствор ( 7М
мочевина, 2М тиомочевина, 0,2% DTT, 0,5% pH3–10 NL IPG буфер,
бромфеноловый синий), стрипы IPG (pH 3–10 NL; 24 cm), 12% гель.
Белки фокусировали последовательно (1ч при 500В, 1ч при 1000В и 8,5ч
при 8000В). После фокусирования проводили SDS-PAGE с 12% гелем на
системе Ettan DALT II. Для визуализации использовали метод окрашивания
серебром.

9.

Результат двумерного электрофореза

10.

11.

Одномерный электрофорез
Реактивы: белки мембран микросом,
100 мM Na2CO3, (рН 11,5),
денатурирующий буфер (5%
меркаптоэтанол, 2% SDS, 0.06M Tris-HCl,
pH 6.8, 10% глицерол),12% гель,
Coomassie Brilliant Blue G.
Электрофорез проводили при 80В в
течение 20 мин, затем при 100В в
течение 2 часов. Гели визуализировали с
помощью Coomassie Brilliant Blue G

12.

Белки, присутствующие в обоих электрофорезах

13.

Выводы
1. Комбинация одномерного и двумерного электрофорезов была более
эффективной для анализа микросом
2. Получение микросом печени было оптимизировано
3. Статья является важным справочным материалом для последующего
анализа микросомных белков, связанных с заболеванием печени

14.

Литература
1. Fang Peng, Xianquan Zhan, Mao-Yu Li, Fan Fang,
Guoqing Li, Cui Li, Peng-Fei Zhang, and Zhuchu Chen.
Proteomic and Bioinformatics Analyses of Mouse Liver
Microsomes. International Journal of Proteomics, 2012