Технологии, используемые в исследованиях лаборатории механизмов нейрохимической модуляции

1. Технологии, используемые в исследованиях лаборатории механизмов нейрохимической модуляции

2.

1. Изменение активности
серотониновых и
дофаминовых структур мозга
и локализованных в них
медиаторных и опиоидных
рецепторов.
Для этого применяется
а). Стереотаксическая техника –
двойной цифровой стереотаксис
(Stoelting Co, USA) и
микроинъекционный насос-310.
Метод используется для
выключения определенных
структур мозга
электролитическим разрушением
или введением нейротоксинов.
Технология является общепринятой для
изучения вклада структур мозга в
регуляцию различных
физиологических процессов, при
этом данный стереотаксис
отличается от других наличием
электронных датчиков перемещения
по трем осям координат, которые
отслеживаются на экране. Прибор
позволяет определять координаты
мозга с точностью от 1 мм. до 10 мк.

3.

EFFECT OF ELECTROLYTIC DESTRUCTION OF THE
NIGROSTRIATAL AND MESOLIMBIC BRAIN STRUCTURES ON
THE IMUNE RESPONSE
AFC/106 ( %)
control
контроль
*
А9
* P<0,001
*
*
n.cd
*
**
А10 n.acc
compared to the control

4.

б). Фармакологический анализ с системным
применением препаратов нового поколения и
высокоизбирательного действия,
активирующих или блокирующих пре- и
постсинаптические рецепторы:
серотониновые 1А , 2А, дофаминовые Д1 и
Д2, опиоидные мю-, капп- и дельтарецепторы.

5.

Pathways of realization of immune response suppression
under activation of serotoninergic (5-НTergic) system (5НТ, 5-НТР, sertraline, 8-ОН-DPAT, DOI, iprazid)
*
300
hypophysis
200
100
*
15
10
5
1
2
2
0
adrenals
Primary and secondary immune
response in BALB/с mice, immunized
with BSA (5 mg/kg), following 5НТР administration (2). Control (1).
1
1
2
0
Increase of СD8+ Т-lymphocyte number in
bone marrow under sertraline (2)
administration. Control (1).
Number of antibody-forming
cells (AFC)
in С57BL/6J mice,
receiving 8-ОН- DPAT(2).
Control (1).

6.

Pathways of realization of immune response stimulation
under activation of dopaminergic (DAergic) system (LDOPA, amantadine, bupropion, apomorphine, quinpirol,
SKF-38393)
30
*
25
20
15
10
5
0
*
*
140
120
*
100
*
*
hypophysis
80
60
Young mice
2,0-2,5 месяца
Control
old mice
apomorphine
2,0-2,5
stress
года
stress+
apomorphine
40
20
0
thymus
25
*
20
15
10
5
2
2
Number of AFC in Wistar rats,
receiving quinpirol (2). Control (1).
30
Activation of DAergic system in old
C57BL/6J mice after stress exposure
elevates the immune reaction to its
level in non-stressed young animals
1
1
1
2
0
Increase of СD4+ Т-lymphocyte number in bone
marrow under bupropione administration (2).
Control (1).

7.

Схематическое изображение серотонинергического нейрона с
обозначением возможной локализации подтипов
серотониновых рецепторов

8. Effect of activation and blockade of pre- and postsynaptic 5-HT1A receptors on the immune response

Effect of activation and blockade of pre- and
postsynaptic 5-HT1A receptors on the immune
800
response
**
Постсинаптические
postsynaptic
рецепторы
5-HT
5-HT
receptors
1A 1A
700
AFC per 106 cells
600
*
500
400
Пресинаптические
presynaptic
5-HT
5-HT
receptors
1A1Aрецепторы
Control
Контроль
300
200
*
100
0 8-OH-DPAT
WAY-100635 WAY-100635 8-OH-DPAT WAY-100635 WAY-100635
1.0 mg/kg
1.0 mg/kg
1.0 mg/kg+ 0.1 mg/kg 0.1 mg/kg
0.1 mg/kg +
8-OH-DPAT
8-OH-DPAT
1.0 mg/kg
0.1mg/kg
*p<0,01, **P<0,001
compared to the control

9.

10.

2. Экспериментальное моделирование различных
психоэмоциональных состояний - один из
основных подходов для изучения патогенетических
механизмов различных психоэмоциональных
отклонений и поиска новых эффективных
терапевтических средств их лечения.
а). Формирование агрессивного, субмиссивного и
депрессивно-подобного поведения при воздействии
хронического социального стресса (метод
дистантного сенсорного контакта).
б). Использование моделей генетически
детерминированного поведения - депрессивноподобное поведение (мыши линии ASCAntidepressant Sensitive Catalepsy), повышенная
агрессивность или отсутствие агрессивности у крыс.

11. I. АГРЕССИВНОЕ, СУБМИССИВНОЕ, ДЕПРЕССИВНО-ПОДОБНОЕ СОСТОЯНИЕ, СФОРМИРОВАННОЕ В РЕЗУЛЬТАТЕ СОЦИАЛЬНЫХ КОНФРОНТАЦИЙ (мыши линии

Экспериментальные модели
I. АГРЕССИВНОЕ, СУБМИССИВНОЕ, ДЕПРЕССИВНОПОДОБНОЕ СОСТОЯНИЕ, СФОРМИРОВАННОЕ В
РЕЗУЛЬТАТЕ СОЦИАЛЬНЫХ КОНФРОНТАЦИЙ (мыши
линии СВА и С57BL/6J)
2 дня
сенсорного
контакта
Введение селективных
препаратов или
соответствующего
растворителя
10 или 20 дней тестирования
конфронтаций
Иммунизация ЭБ (5х108)
Анализ CD4+, CD8+,
CD16/32+
Определение IgM-, IgG-АОК
через 4-9 дней после
введения антигена

12. Экспериментальные модели

II. НАСЛЕДСТВЕННО-ДЕТЕРМИНИРОВАННОЕ ДЕПРЕССИВНОПОДОБНОЕ СОСТОЯНИЕ (мыши линии ASC)
Родительские линии без депрессивного поведения:
СВА (каталептическая линия) AKR (некаталептическая линия)
Мыши линии ASC (Antidepressant sensitive catalepsy)
с повышенной предрасположенностью к каталепсии и
ВЫРАЖЕННЫМ ДЕПРЕССИВНО-ПОДОБНЫМ ПОВЕДЕНИЕМ:
1. Увеличение времени неподвижности в тесте «принудительное плавание»
(Базовкина и др., 2005);
2. Увеличение времени неподвижности в тесте «tail suspension» (Базовкина и др.,
2005);
3. Снижение двигательной активности в тесте «открытое поле» (Базовкина и др.,
2005);
4. Нарушение процесса угашения выработанной реакции пассивного избегания
(Дубровина и др., 2008);
5. Чувствительность к антидепрессантам (имипрамину и флуоксетину) (Тихонова

13. Модели исследования:

Агрессивность, индуцированная социальным
стрессом
I.
Агрессия
нападения «offensive» у мышей линий СВА и
C57BL/6J с различным опытом побед в течение длительных
конфронтационных взаимодействий;
II.
Наследственно детерминированная агрессия:
Защитно-оборонительная
«defensive» агрессия у крыс,
селектированных в течение 70-75 поколений на высокую
агрессивность и ее отсутствие по отношению к человеку (агрессия
, вызванная страхом)

14.

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬ К РАЗЛИЧНОМУ
УРОВНЮ АГРЕССИВНОСТИ У КРЫС
(70-75 поколение селекции диких серых крыс на отсутствие и
усиление агрессивности по отношению к человеку, ФГБУН «ИЦиГ»
СО РАН)
Крысы c высокой агрессивностью характеризуются:
высокой
межсамцовой
агрессией,
повышенным
уровнем
эмоциональности, тревожности и стресс-реактивности, пониженной
исследовательской активностью и способностью к пространственному
обучению в водном тесте Морриса (Plyusnina, Oskina, 1997; Albert et al.,
2008; Konoshenko et al., 2013);
повышенным базальным уровнем адренокортикотропного гормона
(АКТГ) и кортикостерона, а также реакцией гипоталамо-гипофизарнонадпочечниковой системы на стресс (Naumenko et al., 1989;
Plyusnina, Oskina, 1997)
пониженным содержанием серотонина и его метаболита в среднем
мозге и гипоталамусе, сниженной функциональной активностью 5НТ1А- и 5-НТ1С – рецепторов, экспрессией генов 5-НТ1А - и 5-НТ1Срецепторов и высоким уровнем дофамина в стриатуме и

15.

3. Оценка иммунологической реактивности
а). лазерный проточный цитометр-«FACS Сalibur
(Becton Dickinson, USA) с програмным
обеспечением ”CellQuest Pro” для анализа
субпопуляционного состава клеток в
иммунокомпетентных органах и периферической
крови; для приготовления клеток используется
счетчик форменных элементов крови «Пикоскель
ПС-4м» (ООО НПФ «Лабовэй», Россия). В последние
годы появились наборы, позволяющие методом
проточной цитометрии определять и цитокины.

16.

17. Возможности проточной цитометрии

18.

Определение методом проточной
цитофлюориметрии субпопуляции лимфоцитов
меченных трёхцветными МАТ CD3+ CD4+ CD25+

19. Процентное содержание CD4+, CD8+ Т-клеток и их сооотношения (CD4+ /CD8+ ) в периферической крови и селезенке у

неиммунизированных мышей линий CBA и
Периферическая кровь
ASC
CD8+ супрессорные/цитотоксические
Т-клетки
*
40
35
%
%
30
25
20
15
10
5
0
СВА
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
*
4,4
4
3,6
3,2
2,8
**
2,4
2
1,6
1,2
0,8
0,4
СВА
ASC
+
4,8
+
45
+
50
CD4+ /CD8+
CD4 /CD8
CD4+ Т-хелперы
0
ASC
CBA
ASC
Селезенка
40
25
3,2
*
35
10
15
10
+
2
1,6
CD4 /CD8
%
%
15
+
2,4
25
20
2,8
20
*
30
5
*
1,2
0,8
5
0,4
0
0
СВА
ASC
СВА
ASC
0
CBA
ASC

20.

Изменение числа CD4+ и CD8+Т-клеток в костном мозге у
агрессивных и субмиссивных неиммунизированных мышей линии
C57BL/6J после 10-ти и 20-ти дневного тестирования конфронтаций
Субмиссивные мыши
20
СD4 +
22
*
18
16
о
14
12
10
8
6
4
2
СD4 +
СD4 + CD8 +
CD8 +
CD8 +
0
10 дней
20 дней
CD8 +
16
**
14
12
#
**
10
8
6
4
2
0
Контроль
CD8 +
18
20
Количество Тлимфоцитов, %
Количество Т лимфоцитов,%
Агрессивные мыши
24
CD4 +
CD4
+
CD8 +
Контроль
CD4 +
10 дней
* - Р<0,01 * * Р<0,001 по сравнению с контролем ;
о - Р<0,01 по сравнению с агрессивными животными 10-ти дневного теста
# - Р< 0,05 по сравнению с субмиссивными животными 10-ти дневного теста
20 дней

21. Определение цитокинов методом проточной цитометрии (наборы и программа FlowCytomix)

22.

На цитограмме
флюоресценции
отображаются три
цитокина пула Р1 и два
других цитокина пула Р2

23. Данные отчета FlowCytomix по содержанию цитокинов у крыс

24. Содержание IL-1альфа и MCP-1 (пг/мл) в периферической крови у агрессивных и ручных крыс

IL-1альфа
MCP-1
3500
1400
1268
3040
3000
1200
2500
1157
1000
2000
800
1500
1424
1254
600
590
452
1000
400
557,7
500
0
Ручные крысы
200
0
Агрессивные крысы

25.

б). Определение в селезенке числа IgM- и IgGантителообразующих клеток по числу прямых
и непрямых (при добавлении анти-мышинных
антител к иммуноглобулину G) бляшек.
Хотя метод предложен в конце 60 годов, он
рассматривается и сегодня как «золотой
стандарт» оценки числа
антителообразующих клеток на введение Тзависимого антигена (Ladics, 2007), по
которому можно судить о продукции антигенспецифических антител, являющихся
основным защитным механизмом
гуморального иммунного ответа.
Оборудование – микроскопы, термостаты,
бифокальная лупа.

26.

б).

27.

б).

28.

б). Определение в селезенке числа IgM- и IgGантителообразующих клеток по числу прямых
и непрямых (при добавлении анти-мышинных
антител к иммуноглобулину G) бляшек.
Хотя метод предложен в конце 60 годов, он
рассматривается и сегодня как «золотой
стандарт» оценки числа
антителообразующих клеток на введение Тзависимого антигена (Ladics, 2007), по
которому можно судить о продукции антигенспецифических антител, являющихся
основным защитным механизмом
гуморального иммунного ответа.
Оборудование – микроскопы, термостаты,
бифокальная лупа.