Генная инженерия бактерий, высших растений и области ее применения

1. Генная инженерия бактерий, высших растений и области ее применения

1. Нуклеиновые кислоты и факторы
наследственности у животных организмов.
2. Генная инженерия бактерий.
3. Генная инженерия растений.
4. Получение трансгенных растений.
5. Получение трансгенных животных.

2.

• Нуклеиновые кислоты состоят из
моносахаридов (рибозы и дезоксирибозы) и
пуриновых (аденин, гуанин) и
пиримидиновых (цитозин, урацил, тимин)
азотистых оснований.
• В состав рибонуклеиновой кислоты
входит рибоза, аденин, гуанин, цитозин,
урацил, дезоксирибонуклеиновой дезоксирибоза, аденин, гуанин,
цитозин, тимин.

3.

• Нуклеиновые кислоты состоят из компонентов, называемых
нуклеотидами.
• Каждый
нуклеотид
содержит
моносахариды, фосфорную кислоту.
азотистое
основание,
• Нуклеотиды образуют полинуклеотидную цепь.
• Нуклеиновые кислоты
двухцепочечные.
(ДНК)
могут
быть
одно-
и
• ДНК, за редким исключением, двухцепочечные. РНК, за редким
исключением, одноцецочечные.
• При этом азотистые основания располагаются внутри спирали.
• С помощью водородных связей они образуют специфические
пары
• А-Т, Г-Ц - ДНК
• А-У, Г-Ц – РНК

4.

• Важнейшая функция РНК - участие в процессе
синтеза белков в клетке,
• ДНК - определение специфичности и передача
единиц наследственности.
• РНК -информационная (несет информацию ДНК о
первичной структуре белка), транспортная
(транспортирует аминокислоты в рибосомы),
рибосомная (образует рибосомы, собирает белки),
ядерная (4-10% от общей).
• Подавляющая часть ДНК сосредоточена в ядре, в
цитоплазме эукариот содержится менее 1 % всей
ДНК клетки.
• ДНК эукариот почти вся находится в хромосомах
ядер, лишь небольшое ее количество содержится в
митохондриях, а у растений и в плазмидах.

5.

6.

• Каждая хромосома состоит из центральной нити
(хромонемы), вдоль которой расположены
четкообразные структуры (хромомеры).
• Число хромосом колеблется от одной до 100,
чаще 10-50.
• У эукариот хромосомы всегда парные, по две
каждого сорта.
• Наследственными факторами или единицами
наследственности у живых организмов являются
гены, которые лежат в хромосомах в линейном
порядке. Число генов в одной клетке человека
находится в пределах между 5 и 125 тысячами.

7.

• Бактерии содержат по одной хромосоме в
форме замкнутой в виде кольца нити,
состоящей из двухцепочной ДНК и не
имеющей ядерной оболочки.
• В цитоплазме многих бактерий кроме
хромосомной ДНК содержатся добавочные
маленькие кольца ДНК, присутствие
которых необязательно. Они получили
название плазмид

8.

• . Плазмиды несут информацию для 2-200 белков.
• Плазмидная ДНК составляет 1-15% от хромосомной ДНК бактерий.
• Плазмиды способны автономно размножаться и
стабильно наследуются.
• Некоторые плазмиды способны включаться в
хромосому бактерий.
• В одной клетке бактерий мелких плазмид несколько десятков, крупных -одна или две.

9.

10. Генная инженерия бактерий

• Генетическая рекомбинация заключается в
обмене генами между двумя хромосомами.
• Обмен генами и введение в клетку гена,
принадлежащего другому виду, можно
осуществить посредством генетической
рекомбинации

11. Рекомбинация происходит в результате физического разрыва в хромосомах (М) и (F) и их последующего соединения с образованием двух новых хром

Рекомбинация происходит в результате физического разрыва
в хромосомах (М) и (F) и их последующего соединения с
образованием двух новых хромосом (C1 and C2)

12.

• Выделение фрагментов ДНК в хромосомах,
несущих гены с необходимыми свойствами,
производят с помощью вырабатываемых
клетками бактерий ферментов рестрикции
(рестриктаз).
• Рестриктазы распознают в ДНК специфичные
для них участки длиной в 4-6 пар нуклеотидов и
разрезают обе цепи ДНК посередине этих
участков или с некоторым смещением.
• В первом случае образуются обрывки с
ровными (тупыми) концами, во втором стороны оборванных цепочек ДНК чуть-чуть
заходят одна за другую. Такие концы
называются липкими, они могут слипаться
между собой в силу комплиментарности.

13.

14.

• Скрепить липкие концы помогает ДНК-лигаза,
сшивающая фосфодиэфирные связи.
• Для кодирования среднего белка из 400
аминокислот нужен участок ДНК длиной 1200 пар
нуклеотидов.
• В России и за рубежом из различных бактерий
выделено несколько сотен рестриктаз,
разрезающих ДНК в строго определенных местах,
там, где фермент прикреплялся.
• При этом было установлено, что концы
фрагментов ДНК, полученные с помощью
обработки хромосом одной и той же рестриктазой,
способны слипаться между собой в силу
комплиментарности.

15.

16.

• Две совершенно не схожие между собой
последовательности ДНК (например, слона
и лягушки) образуют одинаковые липкие
концы, если эти ДНК обработать одной и
той же рестриктазой.

17.

• . Это дало возможность получать
фрагменты ДНК, содержащие желаемые
гены.
• Участки ДНК, разрезаемые рестриктазами,
несложно разделить с помощью
электрофореза. ДНК, обработанную
рестриктазой, вводят в гель агарозы,
помещенной в электрическое поле.
• Под действием электрического поля
фрагменты ДНК начинают перемещаться в
пористом геле.

18. ДНК, обрабатываемая ДНК-лигазой

19.

20.

• Короткие фрагменты движутся быстрее,
чем длинные, они отделяются друг от
друга, не повреждаются и не утрачивают
биологических свойств.
• Скрепить сцепившиеся липкие концы
фрагментов разных ДНК помогает фермент
ДНК-лигаза.
• Она сшивает фрагменты с образованием
полной структуры двойной спирали ДНК.

21.

• Следующей
задачей
функционально
было
активных,
создание
способных
реплицироваться гибридных ДНК.
• С этой целью интересующий фрагмент ДНК
включают в состав вектора, с помощью которого он
может быть размножен.
• Вектор
-
это
молекула
ДНК,
способная
переносить в клетку чужеродную ДНК любого
происхождения и обеспечивать там ее размножение.
• Клетки, в которые вектор переносит вшитый в
него ген, получили название реципиентов.

22.

23.

• Фаговые векторы тоже обладают рядом
преимуществ.
• Они могут включать в себя более крупные
(более длинные) клонируемые фрагменты
ДНК по сравнению с плазмидными векторами.
• Перенос фагами клонируемого фрагмента в
клетки в результате инфицирования ими
последних является более эффективным, чем
трансформация ДНК.
• Фаговые векторы позволяют более
эффективный скрининг (распознание) на
поверхности агара колоний, содержащих
клетки, несущие клонируемый ген.

24.

• Главное
свойство
способности
плазмид
реплицироваться
состоит
в
их
независимо
от
хромосомы. По размеру ДНК плазмиды в 100 раз
меньше
плазмиде
ДНК
таких
бактериальной
размеров
хромосомы.
все
же
В
может
разместиться до сотни генов.
Плазмиды повышают устойчивость бактерий к
внешним
факторам,
защищают
неблагоприятных воздействий.
их
от

25.

• Выяснилось, что многие мелкие плазмиды содержат по
одному участку для нескольких рестриктаз.
• Каждая такая рестриктаза разрежет кольцо плазмидной
ДНК и переведет ее в линейное состояние.
• Первая такая плазмида была открыта английским
ученым Стэнли Коуэном в 1974 г., которую он назвал
своим именем. Она самостоятельно размножается.
Концы ее способны слипаться между собой или с лю-
быми фрагментами другой ДНК, получаемыми под
действием той же рестриктазы. Несет ген устойчивости
к тетрациклину и легко обнаруживается при выращивании на среде с антибиотиком.

26.

• Следующая
проблема
-
заставить
клетку
воспринять
рекомбинантную ДНК.
• Объектом первых опытов по генной инженерии была избрана
кишечная
палочка
Е.сoli.
Клетки
кишечной
палочки
выдерживают на холоде в растворе кальция, затем подвергают
«тепловому шоку». После этого клеточная мембрана становится
проницаемой для поступления извне молекул ДНК.
• В плазмиду была включена группа генов из хромосомы Е.сoli,
ответственных за синтез аминокислоты триптофана. Когда в
клетки Е.сoli ввели гибридную ДНК, они стали вырабатывать
столько
ферментов,
участвующих
в
биосинтезе
этой
аминокислоты, что бактерии превратились в фабрику по
производству триптофана.

27.

• Помимо плазмид, в качестве векторов стали
использовать и ДНК вирусов, размножающихся в
клетках бактерий.
• Клетка,
получившая
гибридную
ДНК,
размножившись, образует клон.
• Это открыло путь для производства различных
белков, лекарственных препаратов, гормонов, путем
искусственного синтеза их генов и вставки их в
клетки с помощью плазмид. Важнейший из них инсулин, получаемый из поджелудочной железы
свиней.

28. Генная инженерия растений

• Как ввести интересующие нас гены в
растительную клетку, тем самым получить
растения с необходимыми признаками и
свойствами?

29.

• С этой целью были использованы клетки
корончатых галлов - опухолей растений,
образующихся на прикорневой части стебля
у корневой шейки (отсюда название корончатый), на подземных (яблоня) и
надземных (виноград) частях растений, у
прививок в месте стыка привоя с подвоем.
Корончатые галлы - настоящая
злокачественная опухоль.

30.

• Их клетки способны распространяться по
растению от первичного очага и давать
начало вторичным опухолям - метастазам.
• Болезнь поражает свыше 600 видов
преимущественно двудольных растений.
• Возбудителем болезни оказалась бактерия,
выделенная из опухоли винограда в 1897 г.
– Аgrobacterium tumefaciens
(Pseudomonadaceae).

31.

32.

• Если этой бактерией, часто встречающейся в
ризосфере, заразить здоровое, не пораненное
растение, то в области раны разовьется
типичный корончатый галл.
• Опухолевые клетки растут в культуре быстро,
без добавления фитогормонов. Для
возникновения опухоли достаточно
кратковременного контакта с бактерией, само
ее развитие происходит в отсутствии бактерии.
• Под воздействием бактерии нормальные
клетки превращаются в опухолевые, но как это
происходит, долго не удавалось выяснить.

33.

• В 1974 г. было установлено, что патогенные
штаммы агробактерии содержат крупную
плазмиду (150-200 тыс. пар нуклеотидов),
отсутствующую у бактерий патогенных
штаммов.
• Теряют плазмиду при температуре более 30°С.
• Фактор, вызывающий образование опухоли,
связан у агробактерии с крупными плазмидами

34.

• В индуцированных с помощью плазмид
опухолях происходит синтез опинов
(производных аминокислот, в частности
аргинина), использующихся бактериями для
питания.
• Этот механизм осуществляется посредством
переноса плазмидных генов, ответственных за
синтез опинов, от бактерий к растениям и их
последующее существование и проявление в
растении без бактерий.
• Эти гены были выявлены в плазмидах и в
опухолевых растительных клетках бактерии.

35.

• Попадая на ранку подходящего растения, начинают в течение
двух часов активно синтезировать целлюлозу, играющую роль
связующего жгута.
• Еще через 4 часа начинается перенос плазмиды из бактерии в
клетки растения. Заканчивается он через 2 часа.
• Теперь присутствие бактерий становится необязательным для
развития опухолей.
• Онкогены плазмиды встраиваются в растительное ядро, что
ведет к опухолевой трансформации клетки.
• Встраивание происходит с помощью обратного действия
матричной РНК. Плазмидные онкогены кодируют также синтез
фитогормонов (ауксинов, цитокининов), способствующих росту и
делению опухолевых клеток.

36.

37. Получение трансгенных растений

• Новые гены вводят в растения с помощью
агробактерий.
• Наиболее простой путь введения - заражение
пораненных растений с образованием
корончатогалловых опухолей.
• Однако опухолевые клетки не способны к регенерации
растений.
• При заражении растений некоторыми штаммами
агробактерий образуются тератомы - опухоли-уродцы,
состоящие из смеси дифференцированных клеток,
способных дать начало различным частям растений.

38.

• Если этих уродцев привить к здоровому
корню, то можно получить нормальные
растения с чужеродными генами, введенными
через агробактерию.
• Однако потомство таких растений утрачивало
новый признак.
• Новый ген, введенный с онкогенами, не мог
пройти через мейоз, что обусловлено защитой
против опухолевых генов.
• Повреждение онкогенов приводило к тому, что
вставленные гены наследовались в потомстве
клетки с освобожденными от онкогенов, но неповрежденными участками ДНК.

39.

• Участки с вставленным геном и генами опинов
стали культивировать на среде с добавлением
фитогормонов, образованием каллуса и
развитием растения.
• Лишенная онкогенов т-ДНК не мешает
регенерации растительной клетки, способна
пройти через мейоз и наследоваться в
потомстве.
• Для переноса генов с агробактериями их
выдерживают некоторое время с протопластами
растительных клеток.
• Голые протопласты более проницаемы для
крупных молекул, чем одетые клетки.
• Кроме протопластов можно использовать
мезофильные клетки листьев

40. Получение трансгенных животных.

• Эксперименты показали, что культивируемые
клетки высших животных становятся носителями
новых наследственных свойств и продуцируют
новые для них вещества.
• Однако методы генетической инженерии для
млекопитающих и особенно сельскохозяйственных
животных пока слабо разработаны.
• Одной из причин этого является то обстоятельство,
что до сих пор не найдены эффективные и
надежные векторы – плазмиды, которые могли бы
вносить нужные гены в клетки животных

41.

42.

• Другой и, очевидно, главной причиной является глубокая
дифференциация клеток у высших животных.
• Поскольку из соматических клеток высших животных получить
целый многоклеточный организм не представляется возможным,
этот
путь
нельзя
использовать
для
переноса
генов
в
многоклеточное животное.
• Новый подход для направленного изменения генома высших
животных основан на введении в зиготу или ранний эмбрион
клонированных эукариотических генов в составе бактериальных
плазмид.
• Животных, в геном которых интегрируют чужеродные гены,
называют трансгенными.