Иммунитет. Как защититься от защиты?

1. Иммунитет. Как защититься от защиты?

Делаем жизнь человека безопасной
РУКОВОДИТЕЛЬ:
Вдовенко Дарья Юрьевна
Вдовин Александр Сергеевич
УЧАСТНИКИ:
Драгони Оливия
Кашин Кирилл
Невская Анастасия
Тараторкин Федор
Хованская Анна

2.

ПРОБЛЕМА
В настоящее время популярно мнение о том, что иммунитет
человека нуждается в постоянной стимуляции. Однако, в
результате этого множество людей начинают страдать от
аутоиммунных заболеваний и системных воспалений.
АКТУАЛЬНОСТЬ
Механизм влияния активированных клеток на здоровые ткани и
работа иммунитета в целом очень мало изучены, однако их
понимание
является
важным
элементом
обеспечения
безопасного существования человека.
СУЩЕСТВУЮЩИЕ РЕШЕНИЯ
Подавление иммунных реакций – иммунная супрессия.
ВОЗМОЖНЫЕ РЕШЕНИЯ
Изучение влияния активированных иммунных клеток на другие
клетки организма, не нуждающиеся в нем, и последующий поиск
возможных блокаторов этих реакций.
Создание тест системы для определения
предрасположенности к неправильному питанию на основе
ПЦР диагностики вариантов гена-вкуса htas2r38
Делаем жизнь
человека безопасной
Проблема и ее анализ

3.

ЦЕЛЬ ПРОЕКТА
Изучение влияния активированных иммунных клеток на другие
ц
клетки организма на примере
эндотелия и фибробластов
ЗАДАЧИ ПРОЕКТА
• Выделение, активация иммунных клеток и оптимизация этих процессов
(CD3 – Т-клетки).
• Изучение влияния активированных Т-клеток на клетки эндотелия
сосудов (сердечные микроваскулярные клетки и клетки аорты).
• Изучение влияния активированных Т-клеток на фибробласты (кожные и
лёгочные).
Создание тест системы для определения
предрасположенности к неправильному питанию на основе
ПЦР диагностики вариантов гена-вкуса htas2r38
Делаем жизнь
человека безопасной
Цели и задачи проекта

4.

МЕТОДЫ
Проточная цитофлуориметрия (FACS)
Иммуноферментный анализ (ELISA)
Флуоресцентная микроскопия
Искусственная активация клеток и ведение совместных культур
ELISA
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
Флуорисцентная
микроскопия
FACS
Иммунитет. Как защититься от защиты?
Делаем жизнь
человека безопасной
Методы, материалы
и оборудование

5.

МЕТОДЫ
• Культивирование клеток
• MACS (магнитный сортинг специфических субпопуляций клеток)
• Окрашивание MitoSOX на АФК (образование супероксида)
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
Работа проводилась на культурах человеческих клеток дермальных, фетальных
дермальных и легочных фибробластов и сердечных микроваскулярных
эндотелиальных клетках и клетках эндотелия аорты методом совместных культур
с активированными Т-клетками человека.
Иммунитет. Как защититься от защиты?
Делаем жизнь
человека безопасной
Методы, материалы
и оборудование

6.

ОСНОВНАЯ СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТОВ
T-клетки человека
Проверка пролиферации (CFSE)
Count
CD8+ T-клетки
MACS
FITC (CFSE)
Активация Dynabeads
CD4+ T-клетки
Культуры клеток человека
Иммунитет. Как защититься от защиты?
Делаем жизнь
человека безопасной
Методы, материалы
и оборудование

7.

СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ
Анализ морфологии клеток через 24 часа
Отрицательный контроль
Контроль с бидсами
Клетки с CD4
Клетки с CD8
Иммунитет. Как защититься от защиты?
Делаем жизнь
человека безопасной
Положительный контроль с TNFα
Клетки с CD4 и CD8
Методы, материалы
и оборудование

8.

MitoSOX - анализ стресса в клетках эндотелия
MitoSOX – вещество, которое при взаимодействии с
супероксидом (перекись водорода) меняет свой цвет
на красный. Клетки, которые стрессуются,
выделяют именно такой вид оксида, поэтому с
помощью MitiSOX-а можно регистрировать стресс
клеток.
ctr
% апоптотически телец
оценка стапени апоптоза в сокультурах
15
TNFα
10
5
Окрашивание HCMVECs
blue – DAPI
red - MitoSOX
Иммунитет. Как защититься от защиты?
Fα
TN
8/
4
C
D
4
C
D
8
D
C
ct
r
0
Делаем жизнь
человека безопасной
T cells
Результаты работы

9.

Анализ стресса в фибробластах
αSMA - green
Phalloidin – red
DAPI – blue
К фибробластам слева
лимфоциты не добавлены,
а справа- добавлены.
Иммунитет. Как защититься от защиты?
Делаем жизнь
человека безопасной
Результаты работы

10.

Детекция молекул адгезии в эндотелиальных клетках
Окрашивание на CD31 –
маркер эндотелиальных клеток
Определение
субпопуляции нужных
клеток по
светорассеиванию
Выбор отдельных клеток
(исключение дубликатов и
кластеров)

11.

D
4
0
r(
4
Fα
8/
4
TN
C
D
C
D
8
-)
C
D
ct
% клеток с повышенной экспессией
Fα
D
8/
4
TN
C
C
-)
D
8
r(
C
ct
% клеток с повышенной экспессией
E-selectin
50
40
30
20
10
VCAM
2
1
0
4
TN
Fα
8/
4
C
D
8
-)
C
D
r(
C
D
3
ct
% клеток с повышенной экспессией
Детекция молекул адгезии в эндотелиальных клетках
ICAM
6
4
2
0

12.

ELISA по TNF-α (фактор некроза опухоли)
HCMVECs
Fibroblasts
200
C(TNFa) pg/ml
*
200
100
150
100
50
Эндотелий
C
D
8/
4
4
C
D
8
D
C
ct
r
C
D
8/
4
D
C
D
C
4
0
8
0
ct
r
C(TNFa) pg/ml
300
Фибробласты

13.

ВЫВОДЫ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТА
1. Иммунные клетки (CD4 и CD8) были выделены и активированы самым эффективным способом
(пролиферация до 3х циклов деления у 90% клеток) способом. Для этого использовалось
магнитная MACS сепарация.
2. Было выявлено отрицательное влияние гиперактивированных Т-клеток на здоровые клетки
эндотелия, наблюдаемое в результате изменения морфологии и интенсивного выделения
веществ, характерных для клеток, находящихся в состоянии стресса.
3. Было выявлено отрицательное влияние активированных Т-клеток на здоровые фибробласты,
наблюдаемое в результате изменения морфологии и интенсивного выделения веществ,
характерных для клеток, находящихся в состоянии стресса.
Активация иммунитета является необходимым фактором защиты организма, но
несвоевременная искусственная гиперактивация может быть опасной для здоровых клеток
организма и приводить к непредвиденным последствиям.
Создание тест системы для определения
предрасположенности к неправильному питанию на основе
ПЦР диагностики вариантов гена-вкуса htas2r38
Делаем жизнь
человека безопасной
Выводы и анализ результата

14. БЛАГОДАРНОСТИ

Благодарим своих руководителей
Александра Сергеевича Вдовина
Дарью Юрьевну Вдовенко
Куратора направления Юрия Олеговича Молодых
Руководителя лаборатории «Биохакинг» Александра Ефремова
лаборантов, своих коллег и весь центр «Сириус»!
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!
И, конечно же, древних миног и
миксин, которые развили иммунитет
и теперь мы можем его изучать!