Современные методы диагностики в клинической микробиологии

1. ФГБОУ ВО Самарский государственный медицинский университет Минздрава РФ Кафедра общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллерг

ФГБОУ ВО Самарский государственный медицинский университет Минздрава РФ
Кафедра общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии
Современные методы диагностики в
клинической микробиологии
Доцент, к.м.н. Кондратенко Ольга Владимировна

2. Методы микробиологической диагностики

Микроскопический
Микробиологический (бактериологический, микологический,
вирусологический)
Серологический
Аллергологический
Биологический
Молекулярно-генетические
Масс-спектрометрия

3. Методы микробиологической диагностики

Микроскопический
Микробиологический (бактериологический, микологический,
вирусологический)
Биологический
Серологический
Аллергологический
Молекулярно-генетические
Масс-спектрометрия!

4. «Судьба» микробиологии в России в XX веке

Классическая микробиология
Вирусология
Иммунология
Серологические методы и реакции
ПЦР
Объединение микробиологических лабораторий с КДЛ
Возрождение классической микробиологии

5. Облигатные возбудители инфекционных заболеваний

Контроль с помощью вакцинопрофилактики
Контроль с помощью совершенствования
противоэпидемических мероприятий
Своевременная разработка и внедрение в практику
методических рекомендаций по микробиологической
диагностике

6. Факультативные (условно патогенные) возбудители инфекционных заболеваний

Ежегодное более чем у 100 видов микроорганизмов
обнаруживают патогенетические факторы – значение в
качестве условных патогенов
Регулярные пересмотры классификаций
микроорганизмов с изменением таксономического
положения и наименований
Внедрение в практику принципиально новых методов
исследования

7. Факультативные (условно патогенные) возбудители инфекционных заболеваний

Отсутствие новых методических рекомендаций по работе
с клиническим материалом
Действующий Приказ N 535 «Об унификации
микробиологических (бактериологических) методов
исследования, применяемых в клинико-диагностических
лабораториях лечебно-профилактических учреждений» от
22 апреля 1985 г.

8. Приказ N 535 от 22 апреля 1985 г

«Этиологическая структура возбудителей инфекционных
процессов в последнее десятилетие изменилась: значительно
увеличился удельный вес заболеваний, вызываемых условнопатогенными микроорганизмами (около 200 видов условнопатогенных микроорганизмов). Возрастает роль
неспорообразующих анаэробов и некоторых других видов
микроорганизмов, роль которых в инфекционной патологии
ранее была неизвестна»

9. Факультативные (условно патогенные) возбудители инфекционных заболеваний

750 –> 4600 видов микроорганизмов с
потенциальным значением в патологии
человека

10. Забор и транспортировка материала

МУ 4.2.2039-05. 4.2.
Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы.
Техника сбора и транспортирования биоматериалов в
микробиологические лаборатории.
Методические указания
Дата введения: 01.07.2006

11. Микроскопический метод исследования

Автоматические
покрасочные станции

12. Микроскопический метод исследования

Цель – идентификация микроорганизмов до определенным таксономических
единиц по морфологическим и тинкториальным свойствам
Основные задачи:
1. Определить морфологию микроорганизмов
2. Определить цвет, в который окрашиваются определенные структуры клетки
микроорганизмов
3. Определить наличие или отсутствие микроорганизма в исследуемом
материале

13. Микроскопический метод исследования

Дополнительные задачи:
1. Определить качество поступившего в лабораторию материала
2. Определить наиболее возможного возбудителя патологического процесса
в клиническом материале
3. Выявить взаимоотношения микроорганизмов с клетками организмахозяина
4. По определенным признакам взаимоотношений микроорганизмов с
клетками организма-хозяина клиницист может поставить
предварительный или окончательный диагноз

14. Наиболее распространенные способы окрасок клинического материала для определения микрофлоры

Простые методы
1. Щелочной синькой
2. Фуксином
.Сложные методы
1. По Граму
2. По Цилю-Нильсену
3.По Бурри-Гинсу
4.По Леффлеру (Нейссеру)

15. «Новые» способы окрасок клинического материала для определения микрофлоры

Использование люминесцентных
красителей
1. Аурамин ОО, Родамин С –
микобактерии
2. Калькофлюор белый - грибы

16. Люминесцентные красители для выявления микобактерий

Люминесцентные красители (аурамин ОО, родамин С
и др.) связываются с воскоподобными структурами
микробной клетки. При облучении окрашенных
клеток возбуждающим светом они начинают
светиться оранжевым или ярко-желтым светом на
черном или темно-зеленом фоне.
За счет свечения вокруг клетки образуется ореол,
благодаря которому видимые размеры светящейся
клетки превышают ее физические размеры.

17. Люминесцентные красители для выявления микобактерий

В связи с этим окрашенные флюорохромными красителями препараты обычно
исследуются при увеличении 250x - 450x, тогда как окрашенные фуксином - при
увеличении 800x - 1000x. Разница в увеличении позволяет микроскописту
видеть одновременно в 4 -10 раз большее поле зрения, что существенно
сокращает время, необходимое для просмотра мазка. Подсчитано, что если
микроскопическое исследование необходимой площади мазка при окраске по
Ziehl-Neelsen продолжается приблизительно 10 минут, то для исследования той
же площади мазка методом люминесцентной микроскопии потребуется
только
2 - 3 минуты.

18.

ПРИКАЗ
от 21 марта 2003 г. N 109
О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ
ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ
В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

19. Микобактерии (окраска ауромин/родамин)

20. Микроскопия грибов с использованием калькофлюора белого

При обследовании 25 пациентов с диагнозом «зооантропонозная
трихофития» использовали 2 метода диагностики: с использованием
10%-ного раствора едкого калия (КОН) — 1-я группа и 10%-ного
раствора КОН с добавлением калькофлюора белого — 2-я
группа. Было установлено, что во 2-й группе положительный результат
составил 88% случаев (22 больных), а в 1-й группе — 76% случаев (19
больных). Таким образом, использование калькофлюора белого на
11% повысило диагностические возможности микроскопии.
З.Р. Хисматуллина, Д.Р. Попова, О.Р. Мухамадеева, Г.Р. Мустафина. Башкирский государственный
медицинский университет, г. Уфа

21. Грибы (окраска калькофлюор белый)

22. Грибы (окраска калькофлюор белый)

23. Грибы (окраска калькофлюор белый)

24. Клинический пример:

Пациентка Ч., поступила в инфекционное отделение с клиническими симптомами менингита,
сознание спутанное, анамнез собирался со слов родственников. Диагноз ВИЧ/СПИД ранее не
ставился.
Исследуемый материал: ликвор, микроскопия в КДЛ. Врач-микроскопист заподозрила
криптококковый менингит.
Материал направляется в баклабораторию. При микроскопии и последующем посеве типичная
картина криптококкоза.
После этого пациентка обследована на ВИЧ. Результат положительный. Выставлен диагноз
терминальной стадии СПИДа.

25. C.neoformans: микроскопия (нативный мазок из ликвора)

26. C.neoformans: микроскопия (окраска по Граму)

27. C.neoformans: микроскопия (окраска калькофлюор белый)

28. C.neoformans: микроскопия (окраска тушью)

29. Сложные методы окраски Окраска по Граму

Используется несколько красителей
Дает возможность оценить морфологические и
тинкториальные особенности микроорганизма
(идентификация до рода (Грам +) и его взаимоотношения
с клетками организма-хозяина

30. Оценка качества клинического материала до начала работы

Образцы, в которых количество эпителиоцитов не превышает 10, а
количество сегментоядерных лейкоцитов более 25 в поле зрения,
используются для дальнейшего исследования.

31. Микроскопическая картина мазка

32. Причины ошибок при микроскопическом исследовании

Нити фибрина
Щеточная кайма эпителия
Коллагеновые и эластические волокна
Фиброциты
Измененные эритроциты
Вакуоли и ядра измененных макрофагов
Осадки красителей
Жировые капли

33. Заключение по результатам микроскопического исследования

Заключение должно отображать патологический процесс
(количество лейкоцитов, фиброз, пролиферация), количественный и
качественный состав микрофлоры, наличие возбудителей микозов
Заключение формируется не в виде диагноза, а как развернутое
описание микроскопической картины

34. Заключение по результатам микроскопического исследования

Формулировка диагноза в заключении по результатам
микроскопического исследования недопустима, так как она
является прерогативой лечащего врача, а не лабораторного
работника.

35. Национальное руководство

Клиническая лабораторная диагностика
Том II
Научное общество специалистов лабораторной медицины
2012 г.

36. Микробиологический метод исследования

1-й день
• Посев
клинического
материала
2-й день
• Выделение
чистой
культуры
3-день
• Идентификация
чистой
культуры

37. Микробиологический метод исследования

Окончательный результат с определением чувствительности к
антимикробным препаратам через 4-7-10 дней
Международные стандарты 48-72 часа (в идеале первые сутки после
получения клинического материала)

38. Микробиологический метод исследования

1-й день
• Посев клинического
материала

39. Микробиологический метод исследования

Использование специальных хромогенных сред и
сред с добавлением селективных добавок

40. Микробиологический метод исследования

41. Микробиологический метод исследования

42. Микробиологический метод исследования

43. Микробиологический метод исследования

44. Зачем так много?

Рост на агаре через 24 часа инкубации
Рост на агаре через 72 часа инкубации

45. Микробиологический метод исследования Хромогенные среды

Идентификация микроорганизмов до группы, рода,
вида, подвида
Возможность определения чувствительности к
антимикробным препаратам

46. Микробиологический метод исследования

Определение продукции БЛРС
Определение MRSA с помощью хромогенных сред

47. Микробиологический метод исследования Хромогенные среды

Позволяют сократить исследование до 2-3 дней
В некоторых случаях до 24 часов
Позволяют выделять и идентифицировать микроорганизмы при
первичном посеве
Сокращают расходы на дополнительную идентификацию

48. Микробиологический метод исследования

2-й день
• Выделение чистой культуры

49. Микробиологический метод исследования

Использования для идентификации микроорганизмов современных тестсистем позволяет не накапливать чистую культуру
Идентификация проводится с использованием одной или нескольких колоний,
выросших на чашке с первичным посевом
Сокращение исследования на один день

50. Идентификация: какие варианты?

Способ идентификации
Пример
Достоинства
Недостатки
Классическая биохимическая
пестрые ряды, тест-системы
(API, BioMerieux
автоматические анализаторы
(Vitek, WalkAway)
Хорошая идентификация для
большинства микробов.
Высокая стоимость
исследования, высокая
стоимость прибора. Низкая
достоверность на некоторые
НФГОБ
Времяпролетная MALDI-TOFMASS-спектрометрия
Bruker, BioMerieux
Очень высокая точность
идентификацияя, низкая
стоимость исследования
Высокая стоимость прибора.
Очень высокая
достоверность.
Высокая стоимость
исследования и прибора.
Недоступность для многих
регионов
16s-РНК-секвенирование

51. Микробиологический метод исследования

Автоматические анализаторы
Тест-системы для полуавтоматического и ручного использования

52. Автоматические анализаторы

53. Тест-системы для полуавтоматического и ручного использования

54. Тест-системы для полуавтоматического и ручного использования

55. MALDI-TOF масс-спектрометрия

56.

57.

58.

59.

60.

61. Микробиологический метод исследования

3-й день
• Определение чувствительности
к антимикробным препаратам

62. Определение чувствительности к антибактериальным препаратам

63. Благодарим за внимание