Световая микроскопия в ботанике и микробиологии

1. СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ В БОТАНИКЕ И МИКРОБИОЛОГИИ

2.

• Нетрусов А.И., Котова И.Б. Микробиология :
учебник : для студентов вузов, обучающихся
по направлению подготовки бакалавра
"Биология" и биологическим специальностям
/ А. И. Нетрусов, И. Б. Котова. - Москва:
Академия, 2007. 350 с.
• Теппер Е.З., Шильникова В. К., Переверзева
Г. И. Практикум по микробиологии : учебное
пособие для студентов вузов, обучающихся
по специальности 012400 "Микробиология" и
биологическим специальностям / Е. З.
Теппер, В. К. Шильникова, Г. И. Переверзева .
- Москва: Дрофа, 2005. 256 с.

3.

• Дисциплина «Световая микроскопия в
ботанике и микробиологии»
рассматривает историю развития
методов и приборного обеспечения
микроскопических исследований в
биологии, теорию и практику световой
микроскопии в зависимости от целей и
задач биологического исследования.

4.

• Микроскопом называется уникальный
прибор, призванный увеличивать
микроизображения и измерять размеры
объектов или структурные образования,
наблюдаемые через объектив. Эта
разработка удивительна, а значение
изобретения микроскопа чрезвычайно
велико, ведь без него не существовало
бы некоторых направлений
современной науки.

5.

• Микроскоп - родственное телескопу
устройство, которое применяется для
совершенно других целей. С помощью
него удается рассмотреть структуру
объектов, которые невидимы глазом.
Он позволяет определять
морфологические параметры
микрообразований, а также оценивать
их объемное расположение.

6.

7. Строение и принцип работы зрительного анализатора.

• Зрительный анализатор состоит из трёх
частей. Периферическая часть
представлена глазами, проводниковая
— зрительными нервами, центральная
— зрительной зоной коры больших
полушарий. С участием
всех трёх элементов воспринимаются и
анализируются световые раздражители
и мы видим окружающий мир.

8.

• В глазном яблоке выделяют три оболочки:
наружную, сосудистую и сетчатую.
• Наружная (белочная) оболочка в передней
части представлена прозрачной
выпуклой роговицей, а в задней части —
непрозрачной белой склерой.
• Сосудистая оболочка снабжает глаз кровью.
В передней её части находится радужка.
Клетки радужки содержат пигмент меланин,
от количества которого зависит её цвет. В
центральной части радужки
находится зрачок. Зрачок может
расширяться и сужаться в зависимости от
яркости света.

9.

• За зрачком располагается хрусталик —
двояковыпуклая прозрачная линза. Хрусталик может
изменять свою кривизну и фокусировать световые
лучи на внутренней оболочке глаза. Этот процесс
называется аккомодация.
• Между роговицей и радужкой находится передняя
камера, между радужкой и хрусталиком — задняя
камера. В них содержится жидкость, которая
снабжает роговицу и хрусталик питательными
веществами.
• Пространство за хрусталиком
заполнено стекловидным телом.

10.

• Внутренняя оболочка глаза —
сетчатка содержит светочувствитель
ные клетки(фоторецепторы),
представленные палочками и колбочк
ами.

11.

• Палочки обеспечивают сумеречное зрение.
Колбочки реагируют на яркий свет и
обеспечивают цветное зрение. В сетчатке
содержится три вида колбочек: одни
воспринимают красный цвет, другие —
зелёный, третьи — синий. В результате
взаимодействия всех трёх видов колбочек мы
видим разные цвета.
• Большая часть колбочек располагается в
средней части сетчатки и образует так
называемое жёлтое пятно. Место выхода
зрительного нерва из сетчатки не содержит
фоторецепторов и называется слепым
пятном.

12.

13. разрешающая способность оптических приборов

• разреша́ющая спосо́бность оптических приборов
характеризует их способность давать раздельные изо
бражения двух близких друг к другу точек объекта. Из
-за дифракции света изображение точки —
кружок (светлое пятно, окружённое кольцами).
• Наименьшее
линейное или угловое расстояние между двумя точка
ми, начиная с которого их изображения сливаются,на
зывается линейным или угловым пределом разрешен
ия.

14.

• человек с нормальным зрением на
оптимальном расстоянии (25–30 см)
может различить в виде точки предмет
размером 0,07–0,08 мм: такова
разрешающая способность глаза
• Продольный размер инфузории
туфельки составляет примерно 0,03 мм.

15.

• Световая микроскопия обеспечивает
увеличение до 2–3 тысяч раз, цветное и
подвижное изображение живого объекта,
возможность микрокиносъемки и длительного
наблюдения одного и того же объекта, оценку
его динамики и химизма. Изображение в
световом микроскопе формируется
вследствие того, что объект и различные его
структуры избирательно поглощают свет с
различной длиной волны (абсорбционный
контраст) или вследствие изменения фазы
световой волны при прохождении света через
объект (фазовый контраст).

16.

• Контраст изображения – это различие яркостей
изображения и фона. Если это различие составляет
менее 3–4 %, то его невозможно уловить ни глазом,
ни фотопластинкой; тогда изображение останется
невидимым, даже если микроскоп разрешает его
детали. На контраст влияют как свойства объекта,
изменяющие световой поток по сравнению с фоном,
так и способности оптики уловить возникающие
различия в свойствах луча. Возможности светового
микроскопа ограничены волновой природой света.
Физические свойства света – цвет (длина волны),
яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и
направление распространения волны изменяются в
зависимости от свойств объекта. Эти различия и
используются в современных микроскопах для
создания контраста.

17.

• Увеличение микроскопа определяется как
произведение увеличения объектива на
увеличение окуляра. У типичных
исследовательских микроскопов увеличение
окуляра равно 10, а увеличение объективов –
10, 40 и 100. Соответственно, увеличение
такого микроскопа составляет от 100 до 1
000. Некоторые из микроскопов имеют
увеличение до 2 000. Еще более высокое
увеличение не имеет смысла, так как при
этом разрешающая способность не
улучшается. Напротив, качество изображения
ухудшается.

18.

• Световая микроскопия включает
обычную просвечивающую
микроскопию (светло-,
темнопольную), фазовоконтрастную, люминесцентную. В
последнее время разработаны и другие
способы микроскопии и микроскопы –
инверсионная и конфокальная
лазерная сканирующая микроскопия.

19.

• Фазово-контрастная
микроскопия позволяет более четко
наблюдать живые прозрачные объекты,
которые имеют коэффициенты преломления,
близкие к коэффициентам преломления
среды. Действие фазово-контрастного
микроскопа основано на интерференции
света в плоскости изображения,
обусловленной сдвигом по фазе (при
использовании фазового кольца в апертурной
диафрагме). При фазово-контрастной
микроскопии часто применяют биологические
микроскопы с обратным расположением
оптики – инвертированные микроскопы. У
таких микроскопов объективы расположены
снизу, а конденсор – сверху.

20.

• С помощью фазово-контрастной
микроскопии изучают форму, размеры,
взаимное расположение клеток, их
подвижность, размножение,
прорастание спор микроорганизмов и т.
д. Благодаря применению этого способа
микроскопии контраст живых
неокрашенных микроорганизмов резко
увеличивается и они выглядят темными
на светлом фоне (позитивный фазовый
контраст) или светлыми на темном
фоне (негативный фазовый контраст).

21.

• Темнопольная микроскопия основана на
освещении объекта косыми лучами света.
При таком освещении лучи не попадают в
объектив, поэтому поле зрения выглядит
темным. Такое освещение препарата
достигается использованием специального
темнопольного конденсора. Темнопольная
микроскопия является очень простым, но
эффективным методом и хорошо подходит
для получения изображения живых и
неокрашенных биологических образцов.
Учитывая простоту установки, качество
получаемых изображений весьма хорошее.

22.

• При микроскопировании в темном поле
можно увидеть объекты, величина
которых измеряется сотыми долями
микрометра, что находится за
пределами разрешающей способности
обычного светлопольного микроскопа.
Однако наблюдение за объектами в
темном поле позволяет исследовать
только контуры клеток и не дает
возможности рассмотреть их
внутреннюю структуру.

23.

• Люминесцентная (флуоресцентная)
микроскопия основана на способности
ряда веществ биологического
происхождения или некоторых
красителей светиться при их освещении
невидимым ультрафиолетовым или
синим светом. При использовании
ультрафиолетового света разрешающая
способность микроскопа может
достигать 0,1 мкм.

24.

• Клетки микроорганизмов обрабатывают
специальными красителями – флуорохромами
(акридиновый оранжевый, примулин, родамин и др.)
в виде сильно разбавленных водных растворов:
1:500–1:100 000. Такие растворы слабо токсичны, что
дает возможность изучать неповрежденную клетку. В
зависимости от химического состава, клеточные
структуры в разной степени адсорбируют красители и
люминесцируют различным образом. Кроме того,
флуорохромы неодинаково адсорбируются живыми и
мертвыми клетками. Это позволяет использовать
данный вид микроскопии для цитологических и
иммунологических исследований, определения
жизнеспособности клеток и т. д.

25.

• Электронная микроскопия позволяет
обнаружить объекты, которые не
разрешаются при использовании
световых или ультрафиолетовых лучей.
Теоретически разрешение просвечива
ющего электронного
микроскопа составляет 0,002 нм;
реальное разрешение
современных электронных
микроскопов приближается к 0,1 нм.
На практике разрешение для
биологических объектов достигает 2 нм.

26.

• Короткая длина волны электронов позволяет
различить объекты размером 0,5–1,0 нм. В
современных электронных микроскопах на
экране достигается увеличение 5000– 200
000. Благодаря столь высокому разрешению
становится возможным выявление деталей
бактериальных структур. Например, с
помощью напыления солей тяжелых
металлов, окружающих бактерию и
проникающих в поверхностные неровности,
получают контрастирование за счет
дифференциальной задержки электронов.
Этот эффект получил
название негативного
контрастирования.

27.

• Электронный микроскоп, в котором
изображение формируется благодаря
прохождению (просвечиванию)
электронов через образец,
называют просвечивающим (или
трансмиссионным).

28.

• В сканирующем электронном
микроскопе (растровая электронная
микроскопия (РЭМ) пучок электронов
быстро сканирует поверхность образца,
вызывая излучение, которое формирует
изображение на светящемся экране. Для
РЭМ характерны высокая разрешающая
способность, большой диапазон увеличений
(до 100 000 и выше), большая глубина
фокусировки (~100 мкм), многообразие
режимов работы. Сканирующий микроскоп
дает картину поверхностей и позволяет
получать трехмерное изображение.

29.

• Лазерная конфокальная микроскопия дает
возможность получить отчетливое изображение и
наблюдать объекты в фокусе по всему полю. Данный
метод пригоден лишь для исследования
самосветящихся (флуоресцентных) объектов. При
сочетании с компъютерной техникой возможна
пространственная реконструкция изучаемого
объекта. В конфокальном лазерном сканирующем
микроскопе изображения внутренних сечений
формируются за счет сканирования
сфокусированным лазерным пучком от разных (405,
488, 532, 635 нм) лазеров и пространственной
фильтрации излучения. При использовании
сканирующей микроскопии ближнего поля (СМБП)
достигается высокая разрешающая способность.

30.

• Наименьший размер элемента, полученного с
помощью СМБП, составляет 20 нм при длине
волны света 0,486 нм. В изображении
контролируемого элемента отсутствуют
дифракционные или интерференционные
эффекты, затрудняющие определение его
границ. Отличительной особенностью СМБП
по сравнению с атомно-силовым
микроскопом является чувствительность к
оптическим характеристикам поверхности
контролируемого образца, длине волны
света, люминесценции и др.

31.

• Компьютерная интерференционная
микроскопия позволяет получить
высококонтрастное изображение при
наблюдении субклеточных структур; во
многих случаях применяется для изучения
живых клеток. Принцип действия
автоматизированного интерференционного
микроскопа основан на интерференции
световых пучков лазерного излучения,
отраженного от опорного зеркала и зеркала,
на котором помещен измеряемый фазовый
объект. Теоретически предельно достижимая
разрешающая способность может составить
в среднем 0,2 нм, практически она составляет
0,4 мкм.

32.

• Рентгеновская компьютерная
томография (РКТ), позитронная
эмиссионная
томография (ПЭТ) позволяют
наблюдать объекты в обычных
условиях.

33.

• История микроскопии началась в
древнем Вавилоне…
• Первые линзы использовались для
того, чтобы улучшать видимость
отдаленных или микроскопических
объектов, фокусировать солнечный свет
для производства огня, для ориентации
на местности, в медицинских целях, в
металлургии, в астрономии.

34.

• Древние линзы изготавливались чаще всего
из берилла, кварца и горного хрусталя. Так, в
развалинах древнего дворца на Крите была
обнаружена линза из хрусталя, время
изготовления которой относят к 1600 году до
нашей эры. Возраст линз, найденных при
раскопках Трои, датируют примерно 2500
годом до нашей эры. Много линз найдено при
раскопках в Греции, Италии, Египте. В
Месопотамии были найдены первые линзы из
стекла, примерный возраст которых относят к
V-IV векам до нашей эры.

35.

• Способность систем из двух линз
увеличивать изображение предметов
была известна мастерам,
изготовлявшим очки.
• Впервые, что то похожее на очки начали
изготавливать на родине современного
стекла – в Северной Италии. Они
использовали полушаровидные и
плосковыпуклые линзы.

36.

• Считают, что очки изобрел монах
Алессандро Спине или Сальвино
Д'Армате в конце XIII века в Италии.
Первое документальное подтверждение
существования очков появилось в 1289
году, а первое изображение очков было
найдено на фреске, написанной в 1352
году в церкви Тревизо.

37. Леонардо да Винчи

• Изобрел все.
• Изучал строение человеческого глаза,
природу бинакулярного зрения.
• Создал искусственный глаз.

38.

39.

• Вероятность того, что первооткрывателем
устройства стал Ханс Янсен, голландский
мастер по производству очков, достаточно
высока. Его сыном, Захарием Янсеном, в
1590 году было сделано заявление, что он
вместе с отцом сконструировал микроскоп.
• Есть версия, что первый микроскоп создал
Корнелиус Дреббель.
• Этот первый микроскоп мог увеличивать
изображение всего в 3–9 раз. Фокусировка на
исследуемом объекте достигалась за счет
выдвижного тубуса.

40.

• Две выпуклые линзы внутри одной
трубки. Аппарат, похожий на первый в
мире микроскоп.

41.

• В 1609 году Галилео Галилей
изобретает микроскоп "оккиолино"—
«маленький глаз», с выпуклой и
вогнутой линзами внутри свинцовой
трубки.
• Декарт в своей книге "Диоптрика"
(1637 г.) описал сложный микроскоп,
составленный из двух линз - плосковогнутой (окуляр) и двояковыпуклой
(объектив).
• Каждый следующий микроскоп был
лучше предыдущего.

42.

• В 1625 г. членом Римской "Академии
зорких" ("Akudemia dei lincei") И.
Фабером был предложен термин
"микроскоп".

43.

• Оптические артефакты — аберрации —
не позволяли рассматривать мелкие объекты,
даже когда удавалось достичь больших
увеличений. В XVIII веке некоторые мастераоптики смогли устранить хроматические
и сферические аберрации с помощью
сложных оптических систем, состоящих
из собирающей и рассеивающей линз
из разного типа стекол с разными
показателями преломления. Ахроматические
линзы (то есть линзы, устраняющие
хроматические аберрации) изобрел Честер
Мур Халл в 1733 году.

44.

• Первые ахроматические объективы для
микроскопов создал Бенджамин Мартин
(около 1775 г.) и значительно улучшил
Йозеф Фраунгофер. Отец известного
хирурга и отца антисептики Джозефа
Листера — Джозеф Джексон Листер —
обнаружил, что сочетание нескольких
ахроматических линз позволяет
исправить не только хроматические,
но и сферические аберрации (1826 г.).

45.

Суп из чудовищ- вода Темзы.William Heath.1828

46.

• Решающее значение для возникновения микроскопии
имело изобретение микроскопа, первые образцы
которого были созданы в начале XVII века (Г. и 3.
Янсены, Г. Галилей и др.). Одно из самых ранних
научных исследований с помощью микроскопа
собственной конструкции провел английский ученый
Роберт Гук (1635-1703). Он изучал микроскопическое
строение многих предметов. Все изученные объекты
Р. Гук описал в книге "Микрография или некоторые
физиологические описания мельчайших тел,
выполненные при посредстве увеличительных
стекол...", изданной в 1665 г. Из своих наблюдений Р.
Гук сделал вывод о широком распространении
пузырьковидных клеток, или ячеек, в растительных
объектах и впервые предложил термин "клетка".

47.

• С улучшением оптики в 1674 г.
Антони ван Левенгук изготовил
линзы с увеличением, достаточным
для проведения простых научных
наблюдений.

48.

• Основное тело этих микроскопов
состояло из 2 склепанных вместе
плоских и тонких металлических
(обычно латунь) пластин, между
которыми были помещены
небольшие двояковыпуклые линзы с
возможным увеличением от 70 до
250 раз в зависимости от их качества.

49.

Лучшие лупы Левенгука увеличивали в 270 раз.
С ними он увидел впервые кровеносные тельца,
движение крови в капиллярных сосудах хвоста
головастика, полосатость мускулов. Он открыл
инфузории. Он впервые погрузился в мир
микроскопических одноклеточных водорослей,
где лежит граница между животным и растением;
где движущееся животное, как зеленое растение,
обладает хлорофиллом и питается, поглощая
свет; где растение, еще прикрепленное к
субстрату, потеряло хлорофилл и заглатывает
бактерии.

50.

• Именно микроскопы Левенгука являются
первыми, которые были завезены в
Россию по указанию Петра I. Во время
пребывания в Дельфте Петр I пригласил к
себе на яхту Левенгука, который
продемонстрировал
усовершенствованные им микроскопы и
показал ряд экспериментов. После чего
микроскопы были приобретены и
посланы в Россию. Отечественные же
микроскопы впервые были
сконструированы в XVIII веке.

51.

• Развитие оптики в XVIII веке позволяло
исследовать микромир на больших
увеличениях, однако исследование
тканей и клеток было сопряжено
со множеством трудностей — они же
в основном не окрашены,
малоконтрастны и быстро умирают вне
организма. Очередной прорыв
в микроскопии пришел со стороны
химии.

52.

• В XIX веке открыли огромное
количество красителей, и биологи
пробовали окрашивать ими объекты
своих исследований. Одновременно
изобрели микротом — прибор для
нарезания тонких срезов тканей
определенной толщины.

53.

• Для стабилизации структуры ткани
выдерживали в растворах фиксаторов
(например, формалина), после чего
препараты хранились долгое время.
Для удобства нарезания
заформалиненные куски органов
заключали в парафин, блоки которого
удобно резать.

54.

55. Вопросы для зачета

• 1. Классические методы световой
микроскопии
• 2. Строение и принцип функционирования
зрительного анализатора человека.
• 3. История открытия микроскопа и первые
опыты биологической микроскопии.
• 4. Микроскопы для работы в проходящем и
отраженном свете.
• 5. Микроскопия в светлом и темном поле.

56.

• 6. Иммерсионная микроскопия.
• 7. Поляризационный микроскоп.
• 8. Метод интерференционной
микроскопии
• 9. Метод ультрамикроскопии
• 10. Метод фазово-контрастной
микроскопии

57.

10. Метод фазово-контрастной микроскопии
11. Принцип работы электронного микроскопа
12. Метод аноптральной микроскопии,
13. Методы лазерной и конфокальной
микроскопии
• 14. Методы измерения линейных размеров,
площади и объема микроскопических
объектов.
• 15. Устройство светового микроскопа и
принцип его работы.
• 16. Цифровые микроскопные системы
визуализации и правила работы с ними.