Центрифугалау әдістері

1. Центрифугалау әдістері

Орындаған : Адилбекова Асем.

2.

Суспензиядағы бөлшектерді немесе сұйықтағы
макромолекулаларды салмағы және пішіні бойынша бір-бірінен
оңай бөлу үшін центрифугаларды пайдаланады.
Центрифуга негізінен электр моторынан, онымен жалғасқан
ротордан және айналатын роторды сыртқы ортадан бөліп
тұратын камерадан тұрады.

3.

Ішіндегі компоненттерін
бір-бірінен бөлу үшін қоспаны
центрифуганың арнайы
ыдысшасына (пробиркасына)
құяды, содан кейін оны
центрифуганың роторының
арнайы ұяларына ендіріп
орналастырады. Ротор дегеніміз
– денесі қалың металдан
жасалған, ішінде симметриялы
түрде пробирка ендірілетін
ұялары бар периметрі дөңгелек
бөлшек. Оның ішіндегі ұялардың
саны және үлкендігі айналымға
түсетін ерітіндінің көлеміне
байланысты 6-дан 24-ке дейін
болады.

4.

Центрифугалаудың
нәтижесінде пробиркадағы
суспензия негізінен екі фракцияға
бөлінеді. Біріншісі тұнбаның өзі
болса, екіншісі - тұнбаның жоғары
бөлігіндегі тазаланған мөлдір
сұйық. Жоғарыда айтып
кеткендей, клеткадан алынған таза
сұйықты экстракт дейді. Басқа
жағдайларда, мысалы, сол
экстракттың ішіндегі бірқатар
белоктардың түрін қыздыру
арқылы немесе тұндырғыш
(мысалы, тұз) қосып тұнбаға
түсіргеннен кейін центрифугалап
алынған мөлдір сұйықты
супернатант деп атайды.

5.

Центрифугалау әдісінің принципі – центрифуга
арқылы айналдыру кезінде орталықтан тебілетін күштің
әсерінен сұйық қоспадағы түйіршіктер тұнбаға түседі
немесе салмақтары әр түрлі макромолекулалар бір-бірінен
бөлінеді. Центрифугалардың роторларының айналу
жылдамдығы және оған сәйкес олардың заттарды бір-бірінен
бөлу қабілеті байланысты олар баяу жылдамдықты, жоғары
жылдамдықты және ультрацентрифугалар болып бөлінеді
Жылдамдығы жоғары центрифуганың роторлары
1- ұяшықтары тұрақты бұрышта жасалған, 2- ұяшықтары ілінген,
3- ұяшықтары вертикал орналасқан.

6.

Центрифугалау әдістері.
Препаративті
центрифугалау
Дифференциалды
центрифугалау
Тығыздық градиентінде
тепе-теңдікпен
центрифугалау
Аналитикалық
центрифугалау
Молекулалық салмақты
седиментация жылдамдығы
арқылы анықтау

7.

1. Препаративті центрифугалау. Бұл әдіс биологиялық
материалдарды ары қарай биохимиялық жолмен зерттеулерге
жиі қолданылады. Бастапқы биологиялық материалды, мысалы
бактерия, өсімдік немесе жануарлардың клеткалары мен
ұлпаларын белгілі кезеңдер аралығында немесе үздіксіз
қайталап себу арқылы олардың культуралық массасын көп
мөлшерде алуға болады.

8.

Препаративті центрифугаларды негізгі үш топқа
біріктіруге болады: жалпы мақсаттардағы, жылдамдығы
жоғары және препаративтті ультрацентрифугалар.
Жалпы мақсаттардағы центрифугалардың максималды
айналу жылдамдығы минутына 6000 айналысқа тең
болады. Олар бір-бірінен тек айналдыра алатын
биологиялық сұйық материалдардың көлемі бойынша
өзгеше. Олардың бірімен бірін ауыстыруға келетін
роторлары да әртүрлі: бұрышты және ілінген
пробиркалары бар.
Жылдамдығы жоғары центрифугалардың жылдамдығы
минутына 25000 айналыспен шектеледі. Жоғары
жылдамдықпен айналғанда үйкелістің әсерінен ротор
қызып кететін болғандықтан оның ротор камералары
салқындатқыштармен қамтамасыз етілген. Олардың да
роторлары алмастыруға келеді және 1,5 дм3 көлемдегі
сұйықты центрифугалауға болады.
Препаративтті ультрацентрифугалардың жылдамдығы
минутына 75000 айналысқа дейін жетеді. Олар
салқындатқыштар және вакуум қондырғыларымен
жабдықталған (яғни вакуумда ротормен үйкеліске
түсетін ауа болмайды).

9.

2. Дифференциалды центрифугалау. Бұл әдіс үлкендігі және
тығыздығына байланысты бір-бірінен өзгеше болатын
бөлшектердің седиментация кезіндегі тұнбаға түсу
жылдамдықтарына негізделген. Бөлуге арналған материалды,
мысалы ұлпаның гомогенатын, центрден тебілу үдеуі сатылы
кезекпен күшейтіліп отыратын жылдамдықта центрифугалайды.
Ротордың әрбір берілген айналу жылдамдығында бөлшектердің
белгілі бір түрі тұнбаға түсіп отырады. Яғни, оның нәтижесінде
цетрифугалаудың әрбір кезеңінде бөлшектердің белгілі бір
фракциясы тұнбаға түсіп отырады. Әрбір кезеңнен кейін
тұнбаға түскен бөлшектердің фракциясы таза болуы үшін ол
тұнба бірнеше рет жуылып, дәл сол жылдамдықпен
цетрифугаланады.

10.

Дифференциалды центрифугалау
1 - ұлпаның гомогенатын төменгі жылдамдықпен (1000g, 10 мин)
центрифугалайды, 2 - одан алынған тұнбаның құрамында бүтін клеткалар,
ядролар, клетка қабықшалары және плазма мембраналары болады. Оның
супернатантын орташа жылдамдықпен центрифугалайды (20 000g, 20 мин),
3 - одан алынған тұнбаның құрамында митохондрия, лизосома және
пероксисомалар болады. Оның супернатантын жоғары жылдамдықта
центрифугалайды (80 000g, 1 сағ), 4 - одан алынған тұнбаның құрамында
микросомалар немесе эндоплазматикалық тордың сынықтары және кіші
түйіршіктер болады. Оның супернатантын өте жоғары жылдамдықта
центрифугалайды (150 000g, 3 сағ). 5 - одан алынған тұнбада рибосомалар
мен макромолекулалар, ал супернатантында суда еритін белоктар және басқа
биомолекулалар болады.

11.

Изопикникті центрифугалау.
• Мұндай центрифугалауды
тығыздық градиентінде,
сонымен қатар қалыпты
жағдайда жүргізуге болады.
Егер центрифугалау
тығыздық градиентінде
өткізілетін болса, онда
биологиялық препараттың
ішіндегі зерттелетін
қосылыстан ауыр басқа
заттар тұнбаға түсетіндей
етіп центрифугалайды.
Одан алынған
супернатантты ары қарай
оның ішіндегі
молекулалардың
тығыздығына байланысты
бір-бірінен бөлу үшін
таңдап алынған жылдамдық
үдеуінде центрифугалайды.
Зоналы-жылдамдықта
центрифугалау
• Бұл әдісті басқаша sзоналды центрифугалау деп
атайды. Зоналыжылдамдықтағы
центрифугалауды РНҚ-ДНҚ
гибридтерін, рибосоманың
суббірліктерін және басқа
да клетка компоненттерін
бір-бірінен бөлу үшін
пайдаланылады.

12.

Изопикникті (сахароза-тығыздығындағы) центрифугалау
А - сұйық күйдегі биологиялық материалды центрифуга пробиркасының
ішінде сахароза тығыздығының градиентін беретін сұйықтың бетіне ұқыптап
құяды. В – центрифугалау кезінде тығыздығы төмен қосылыстар центрден
тебілетін күштің әсерінен пробирканың түбіне қарай баяу қозғалады.
Тығыздығы жоғары қосылыстар пробирка түбіне қарай жылдам қозғалады. С
– центрифугалау аяқталғаннан кейін центрифуга пробиркасының ішіндегі
сахароза градиенттері қатар қойылған пробиркалардың ішіне ұқыппен
фракциялар түрінде кезегімен жиналады

13.

3. Тығыздық градиентінде тепе-теңдікпен центрифугалау.
Бұл жағдайда тығыздық градиентін құру үшін цезий және
рубидий секілді металдардың тұздарын, сонымен қатар
сахарозаның ерітінділерін қолданады. Зерттелетін препаратты,
мысалы ДНҚ-ны, концентрленген хлорлы цезий ерітіндісімен
араластырады. Ерітіндідегі қосылыс (бұл жерде ДНҚ) және
еріткіштің қоспасы центрифуга пробиркасының барлық
көлемінде біркелкі болып құйылады. Центрифугалау барысында
концентрацияның тепе-тең болып таралуы іске асады. Соның
нәтижесінде цезий ионының массасы үлкен болғандықтан
хлорлы цезийдің де тығыздығы барлық көлемге тепе-тең болып
таралады. Центрден тебілу үдеуінің әсерінен ДНҚ молекулалары
пробиркадағы өздеріне сәйкес келетін тығыздықтың аймағында
бөлекше зона түрінде қайта топтасады. Америка ғалымдары
Месельсон мен Сталь дәл осы әдісті ДНҚ-ның жартылай
консервативті репликациясын ашуда орынды пайдаланған.

14.

4. Аналитикалық центрифугалау.
Биологияда аналитикалы
центрифугалауды
макромолекулалардың молекулалық
салмақтарын анықтау, үлгілердің
тазалығын тексеру, сонымен қатар
макромолекулалардың
конформациялық өзгерістерін зерттеу
үшін қолданылады. Аналитикалық
ультрацентрифуганың көмегімен
молекулалық салмақты анықтаудың
үш әдісі бар: седиментация
жылдамдығын анықтау,
седиментациялық тепе-теңдік әдісі
және седиментациялық тепе-теңдікке
жақындау әдісі.

15.

5. Молекулалық салмақты седиментация жылдамдығы
арқылы анықтау. Бұл кең тараған әдіс. Алғаш барлық
кеңістікке біркелкі таралған бөлшектер үлкен жылдамдықпен
центрифугалау жүргізгенде айналудың центрінен радиус
бойынша рет-ретімен қозғала бастайды. Бөлшектерден босанып
үлгерген еріткіштің аймағы және оның әлі де бөлшектер бар
бөлімінің арасында оларды анық бөліп тұратын шекара пайда
болады. Сол шекара центрифугалау кезінде жылжып,
бөлшектердің седиментциясының жылдамдығын анықтауға
мүмкіндік береді, фотопарақта тіркеліп отырады.