Методы выделения, концентрирования и очистки целевого продукта

1.

Методы выделения,
концентрирования и очистки
целевого продукта.
1

2.

Содержание
1. Введение.
2. Подходы к выбору методов выделения
и концентрирования микроорганизмов и
продуктов микробного синтеза.
3. Основные методы выделения и
концентрирования, преимущества и
недостатки.
4. Заключение.
2

3.

1. Загоскина Н. В., Назаренко Л. В., Калашникова
Е. А., Живухина Е. А. Биотехнология. Теория и
практика; Оникс - Москва, 2009. - 496 c.
2. . Клунова С. М., Егорова Т. А., Живухина Е. А.
Биотехнология; Академия - Москва, 2010. - 256 c.
3. Под редакцией Воронина Е. С. Биотехнология;
ГИОРД - , 2008. - 704 c
3

4.

Конечным продуктом стадии ферментации является
культуральная жидкость ‒ суспензия микроорганизмов,
содержащая накопленный продукт микробиологического
синтеза.
Целевым продуктом микробиологического синтеза может
быть:
сама биомасса микроорганизмов (инактивированная или
живые клетки)
продукты
метаболизма
(антибиотики,
ферменты,
витамины и т.п.), растворенные в культуральной жидкости
или находящиеся внутри клеток.
Эндометаболит − целевой продукт находится внутри клетки
(накапливается или входит в состав клеточных структур или
оболочки)
Экзометаболит − целевой продукт выделяется клеткой в КЖ

5.

Выбор технологии выделения продуктов
(метаболитов) зависит от места основного
накопления продукта:
– в культуральной жидкости
- используются такие методы, как экстракция,
ионный обмен, адсорбция, кристаллизация
– внутриклеточно
- используют экстракцию,
-или выделяют целевой продукт после
дезинтеграции
(разрушения)
клеточной
стенки

6.

Для внутриклеточных, в первую очередь следует убрать
оболочку одним из следующих методов:
гидролиз – деформация оболочек клетки за счет
использования химреагентов и температурного воздействия;
ферментолиз – разрушение оболочек с помощью ферментов;
дезинтеграция клеток – выполняется при помощи дробления,
замораживания, ультразвукового воздействия или методом
резкого изменения давления.

7.

При выборе метода концентрирования и выделения
микроорганизмов и продуктов микробного синтеза
необходимо учитывать следующие факторы:
- Физико-химические свойства культуральной
жидкости;
- Свойства выделяемого продукта (термолабильность, стойкость к различным химическим элементам
и др);
- Требования к конечной форме продукта (общая и
биологическая концентрация, лекарственная форма,
степень чистоты и степень концентрирования);
- Технологические и технико-экономические
показатели (выход продукта, производительность
оборудования, необходимость дальнейшей
обработки продукта и т.д.).
4

8.

Методы выделения микроорганизмов и
продуктов микробного синтеза из КЖ
I. Если целевой продукт в виде твердой фазы:
1. Осаждение.
2. Флотирование.
3. Фильтрование (микрофильтрация, ультрафильтрация).
4. Центрифугирование.
5. Сепарирование.
II. Если целевой продукт в растворенном виде:
1.
2.
3.
4.
5.
Экстракция.
Адсорбция.
Кристаллизация.
Диализ (обратный осмос).
Упаривание.
5

9.

Осаждение (седиментация) - это процесс,
при котором при добавлении некоторых
реагентов или при изменении физикохимических свойств КЖ, происходит
расслоение дисперсных систем под
действием силы тяжести и отделение
дисперсной фазы в виде нерастворимого
осадка.
6

10.

Отстаивание применяют в следующих случаях:
при диаметре частиц более 3 мкм (броуновское
движение не оказывает существенного влияния на
процесс отставания);
при выделении стабильных продуктов (фактор
времени не имеет решающего значения);
когда необходимо разделить частицы на фракции по
размеру или плотности на основании их различных
скоростей осаждения;
если необходимо предварительно разделить
суспензию на две фракции: осадок и надосадочную
жидкость, которые в дальнейшем можно обрабатывать
на различном оборудовании.
8

11.

Коагуляция – это процесс образования агрегатов частиц при
изменении их электрических свойств под влиянием электролитов.
Коагулянты - это вещества, переводящие взвешенные
частицы в агрегатно неустойчивое состояние: желатин, рыбный
клей, казеин, органические полиэлектролиты и др.
Флокуляция – это процесс агрегации частиц (белков) под
влиянием поверхностно-активных веществ (ПАВ), которые
гидрофобизируют поверхность твердой фазы.
Флокулянты - это вещества, способствующие разрушению
коллоидных структур и образованию крупных хлопьев:
неорганические вещества (активная кремниевая кислота,
квасцы, соли железа и кальция), природные полимеры (крахмал,
декстран, метилцеллюлоза, пектин и др.), синтетические
полимеры (полиэтиленоксид, полистиролсульфокислота и др.).
9

12.

Методы осаждения
7

13.

Флотирование – это метод выделения и
концентрирования твердой фазы путем
вспенивания культуральной жидкости
воздухом, при котором взвешенный в
КЖ биологический материал
(микроорганизмы) адсорбируются на
поверхности раздела фаз «воздух –
жидкость» и всплывают вместе с
пузырьками воздуха
10

14.

схемы пенных (пневматических) флотаторов:
1 - корпус; 2, 5 - аэраторы; 3 - штуцер для отвода
отработанной жидкости; 4 - штуцер для отвода
концентрата

15.

Схема флотатора
1 – штуцер для выхода
сгущенной суспензии.
2 – механический
пеногаситель.
3 – корпус.
4 – труба подачи воды.
5 – внутренний стакан.
6 – штуцер для ввода
дрожжевой суспензии.
7 – штуцер для вывода
осветленной жидкости.
11

16.

Схемы электрофлотаторов: 1- камера; 2, 3 - электроды;
4 - ввод культуральной жидкости; 5 - вывод
отработанной жидкости; 6 - отвод концентрата;
7 - пеносъемник

17.

Схемы струйных флотаторов: 1- корпус; 2 - трубы; 3 газовый патрубок; 4 - штуцер входа газа; 5 - штуцер
вывода отработанной жидкости; 6 - штуцер вывода
концентрата; 7 - штуцер ввода суспензии;
8,1 0 - аэраторы

18.

19.

20.

Фильтрование – это процесс разделения твердой и жидкой
фаз КЖ при пропускании ее через пористую перегородку полупроницаемую мембрану.
Мембрана - это высокопористая плоская или трубчатая перегородка, изготовленная из полимерных или неорганических материалов, и способная эффективно разделять частицы различных
видов (ионы, молекулы, макромолекулы и коллоидные частицы),
находящиеся в смеси или в растворе.
На процесс фильтрования влияют:
1. Макрофакторы - разность давлений, толщина слоя осадка,
вязкость жидкой фазы и др. (контролируются с помощью
приборов).
2. Микрофакторы - размер и форма частиц осадка и пор
фильтровальной перегородки, толщина двойного электрического
слоя на поверхности частиц и т.п. (мало изучены, оказывают
решающее влияние на процесс фильтрования и затрудняют его
масштабирование).
12

21.

Для увеличения скорости фильтрования
обычно используют два приема:
1. Ппредварительная обработка суспензий
(кислотная обработка - применяется при
выделении антибиотиков, устойчивых к
низким
рН;
обработка
электролитами;
тепловая коагуляция – для выделения
термостабильных веществ при 70-80°С).
2. Применение
вспомогательных
фильтровальных
материалов
(фильтровальные
порошки,
которые
вносятся в фильтруемую жидкость как
наполнители
или
предварительно
наносятся на рабочую поверхность фильтра
в виде грунтового слоя).

22.

Границы типов фильтрации по размерам частиц
Нано-
Ультра-
Микрофильтрация
Тонкая фильтрация
mite
Blood Cells
Визуально
видимые
Vitamin B12
T4 Phage
10µ
0,
1µ
Flee
Aspergillus
Escherichia Coli
10µ
1µ
Blutzellen
HSA
10
0,001
200
100
0,01
10.000
1.000
10.000
0,1
1
100.000
10
1000.000
Стерильная фильтрация
1.000.000
Angström [Å]
Micron
[µm]
Molecular Weight
[Da]
100

23.

Классификация мембранных методов в
зависимости от размеров фильтруемых частиц
и размеров пор в мембранах
1 нм
Ионы
102 нм
Молекулы
Ультрафильтрация
104 нм
Частицы
Микрофильтрация
Фильтрация
Обратный
осмос
1 нм
102 нм
104 нм
13

24.

Тупиковая фильтрация (статическая)
При этом виде фильтрации жидкость проходит
через мембрану, а частицы (размер которых
больше, чем поры мембраны) задерживаются на её
поверхности. Это означает, что задержанные
частицы
формируют
так
называемую
фильтрационную лепёшку, которая постепенно
снижает фильтрационный эффект до тех пор, пока
не будет проведена регенерация мембраны.

25.

Напорная
(тупиковая)
фильтрация

26.

Фильтрация с
необратимым
забиванием
фильтра
14

27.

Cross-flow фильтрация (динамическая)
В процессе фильтрации жидкость течёт на мембрану не
напрямую а тангенциально (вдоль мембраны). Таким
способом создаётся разница давления по всей мембране.
Вследствие этого, определённый объём жидкости проходит
сквозь мембрану в виде фильтрата, а остальная часть
продолжает движение вдоль мембраны вместе с примесями,
которые в потоке очищают стенки мембраны.

28.

Фильтрация
в
поперечном
потоке
(кросс-флоу)

29.

30.

Расходные материалы для фильтрации в поперечном
потоке
Кассета
137х 50 мм толщиной 10 мм 0,02 м2
137х127 мм толщиной 9 мм 0,1 м2
210х175 мм толщиной 18 мм 0,6/0,7 м2
Содержит пакет попарно
параллельно расположенных
полимерных мембран, между
которыми проходит дренажный
сетчатый слой. Поперечное течение
фильтруемой среды к поверхности
фильтра, возможность "обратной"
промывки и изменения направления
входного потока обеспечивают его
долгий срок службы.

31.

Схема плоскорамного фильтрующего элемента
(кассеты)

32.

33.

34.

Рулонные
фильтрующие
элементы

35.

Установка
Sartoflow 2000 с
рулонными
мембранными
элементами
• от 6 до 32 рулонных фильтров из
полиэфирсульфона
• общая площадь фильтрации
• от 30 до 160 м2
• от 750 до 12.000 л/ч

36.

Ультрафильтрация – это процесс при котором
частицы, имеющие значительно больший размер, чем
частицы растворителя, при пропускании раствора под
давлением через трубчатую мембрану с малым
размером пор задерживаются на внешней стороне
мембраны.
Эффект ультрафильтрации обусловлен:
1. Первичная адсорбция, когда вещество адсорбируется на поверхности фильтра и его порах.
2. Блокировка, когда вещество удерживается
внутри пор, либо выходит из них.
3. Просеивание – вещество механически удерживается на поверхности фильтрующего элемента
(волокна).
16

37.

17

38.

18

39.

Трубчатые фильтрующие элементы
Фильтрат
Сборник
Направление
потока
Резьбовое
подключение
Уплотнительные кольца
Концентрат
Мембрана
Мембранный каркас

40.

УСТАНОВКА УЛЬТРА - И МИКРОФИЛЬТРАЦИИ
С ТРУБЧАТЫМИ ЭЛЕМЕНТАМИ

41.

42.

Достоинства фильтрования
1. Концентрирование и очистка осуществляются без изменения
агрегатного состояния и фазовых превращений материала.
2. Перерабатываемый продукт не подвергается тепловым и
химическим воздействиям.
3. Механическое и гидродинамическое воздействие на
биологический материал незначительно.
4. Легко обеспечиваются герметичность и асептические условия.
5. Аппаратурное оформление просто по конструкции, компактно,
отсутствуют движущиеся детали.
6. Процесс не обладает высокой энергоемкостью, в большинстве
случаев энергия затрачивается только на перекачивание растворов.
Недостатки
1. Некоторые материалы, из которых изготовляются мембраны, не
выдерживают очень высоких и очень низких значений рН или высоких
температур, быстро изнашиваются.
2. Возникают определенные трудности при обработке растворов,
содержащих твердую фазу.
19

43.

Центрифугирование - это
разделение неоднородных
систем под воздействием
центробежных сил
Центрифуга
представляет
собой отстойник, который
вращается
вокруг
центральной
оси.
При
высокой скорости вращения
действие
силы
тяжести
заменяется
регулируемой
центробежной силой, что
гарантирует лучшее качество
процесса при разделении
нескольких жидкостей или
жидкости и твёрдых веществ.
В данном случае процесс
разделения
высокоэффективен, точен и
прост в обслуживании.

44.

Классификация центрифуг по принципу разделения
фильтрующие
осадительные
комбинированные
Фильтрующие центрифуги применяют для глубокого обезвоживания
и высокой степени промывки и отжима осадка.
Осадительные центрифуги применяют для разделения суспензий.
Классификация центрифуг по способу выгрузки осадка
с ручной выгрузкой
гравитационной
инерционной
гидравлической
контейнерной
ножевой
с выталкивающим поршнем
с пульсирующим поршнем
механико - пневматической
21

45.

Вертикальная центрифуга с верхней выгрузкой

46.

Горизонтальная ножевая центрифуга

47.

центрифуга с пульсирующим поршнем

48.

Высокоскоростная
рефрижераторная
напольная
центрифуга
среднего класса
серии ЦРС-8
22

49.

Центрифуга
большого
объема (6,4 л)
с охлаждением
и микропроцессором
23

50.

Суперцентрифуга
типа ОТР и РТР
(скорость вращения
ротора от 8000 до
9000 об/мин-1)
24

51.

Области применения центрифугирования:
выделение биомассы из КЖ;
отделение различных целевых продуктов микробного синтеза
(антибиотики, ферменты, витамины и т.п.), переведенных
предварительно в твердую фазу;
разделение жидкостей, образующихся при экстракции.
Достоинства центрифугирования:
высокая производительность;
высокая степень концентрирования.
Недостатки центрифугирования:
сложность конструкции, высокая энергоемкость и стоимость;
сложность эксплуатации (ненадежность, вибрация, необходимость
периодической разборки и мойки);
воздействие на клетку центробежной силы и нагревания;
трудность герметизации и обеспечения асептических условий
процесса выделения.
20

52.

Сепарирование осуществляют в сепараторах, в которых на
клетки действует центробежная сила, отбрасывающая клетки к
периферии сосуда, а культуральная жидкость будет собираться в
центре сепаратора. Этот процесс протекает гораздо быстрее,
чем отстаивание клеток под действием силы тяжести.

53.

(2) периодический
Отвод твёрдых
веществ (взвесей)
(1) непрерывный
(3) ручной

54.

Центрифуга-сепаратор
Alfa Laval DMRPX 207
25

55.

1. Сепарация чувствительных клеточных
культур млекопитающих.
2. Производство чувствительных вакцин и
антител в стерильных условиях

56.

Классификация сепараторов по технологическому назначению
Сепараторы-разделители
применяемые для
выделения жидкостей, не
растворимых одна в другой,
и для концентрирования
суспензий и эмульсий
Сепараторы-осветлители
предназначенные для
выделения твердых частиц
(в том числе и клеток) из
жидкости
Комбинированные сепараторы
предназначенные для выполнения двух и более
операций переработки жидкой смеси
26

57.

Экстрактор–сепаратор
«Сибирь»
27

58.

Высокоскоростная
бактофуга АХ-213
фирмы «АльфаЛаваль»:
1 – трубка для подачи
жидкости на осветление; 2
– барабан; 3 – карманы
для твердых частиц; 4 –
напорный диск; 5 –
уплотнение; 6 – сопла для
выгрузки твердых частиц;
7 – тарелки; 8 – корпус
рабочего вала; 9 –
масленки; 10 –
амортизатор; 11 –
магнитная муфта; 12 –
электродвигатель; 13 –
основание.
28

59.

Важными факторами при выборе технологии
сепарирования являются:
1. Тип продукта (внутриклеточный,внеклеточный или
включенное тело),
2. Характеристики каждого отдельного организма
(бактерия, дрожжи, мицелла и т.д.),
3. Требуемая скорость потока,
4. Необходимость абсолютной стерильности,
5. Полная герметичность.

60.

Преимущества и недостатки сепараторов
Центробежные сепараторы обладают рядом преимуществ:
· высокая производительность;
· хорошая степень концентрирования, достигается концентрация
биомассы 5-15 % по сухой массе;
· возможность повышения скорости сепарирования предварительной
обработкой жидкости флокулянтами.
При этом в использовании сепараторов есть и недостатки:
· сложность оборудования;
· энергоемкость процесса.
Таким образом, с экономической точки зрения сепарирование как
метод выделения и очистки биотехнологических продуктов менее
выгоден, чем, например, фильтрация и оправдывает себя, если:
· суспензия фильтруется медленно;
· необходимо максимальное освобождение культуральной жидкости от
содержащихся частиц;
· необходим непрерывный процесс сепарации в условиях, когда
фильтры рассчитаны только на периодическое действие.

61.

Экстракцией
в широком смысле называют процессы
извлечения одного или нескольких компонентов из растворов или
твердых
тел
с
помощью
избирательных
растворителей
(экстрагентов). При взаимодействии с экстрагентом в нем хорошо
растворяются только извлекаемые компоненты и значительно слабее
или практически вовсе не растворяются остальные компоненты исходной
смеси.
Экстракция
.
твердо-жидкофазная
жидкофазная
29

62.

Колонные аппараты непрерывного действия
1 – вход легкой
жидкости;
2 – вход тяжелой
жидкости;
3 – выход
экстракта;
4 – выход
рафината;
5 – тарелки;
6 – сетки;
7 — распылитель
а – тарельчатый;
б – пульсационный

63.

Роторно-дисковый экстрактор
1 – корпус;
2 – кольцевые перегородки;
3 – ротор;
4 - привод;
5, 6 – отстойные зоны;
7 – распределитель легкой
фазы

64.

Экстрактор периодического действия

65.

Преимущества метода
1. Низкие затраты.
2. Высокая скорость экстракционных
процессов.
Недостаток
Использование вредных,
взрывоопасных органических веществ.

66.

Адсорбция (ионообмен) – это процесс поглощения
целевого продукта из газовой смеси или раствора
твердым веществом - адсорбентом.
Извлечение адсорбированного вещества из твердого
поглотителя (десорбция) является необходимой составной
частью всех технологических процессов адсорбции,
проводимых в замкнутом цикле.
Наиболее широко применяемые сорбенты:
активированные угли;
селикагель;
цеолиты;
органические и неорганические иониты;
синтетические ионообменные смолы (КУ-2, КБ-4,
КБ-4П-2, КМД, АВ-17 и др).
30

67.

Кристаллизация - это процесс выделения целевого
продукта из раствора в виде кристаллов в результате
изменения его физико-химических свойств, путем
перевода продукта в нерастворимую химическую форму
методом изменения рН раствора или добавлением
определенного реагента с одновременным снижением
температуры

68.

Упаривание – это процесс концентрирования
растворов путем частичнго удаления растворителя
испарением при нагревании жидкости
1 - неподвижный
кожух; 2 - ротор; 3 патрубок подачи
раствора; 4 вращающаяся
пластина (конус); 5 отводная трубка. G,c начальный и конечный
расход суспензии; Gu,
W - первичный и
вторичный расход пара
Центробежный испаритель с вращающейся поверхностью теплообмена

69.

70.

Диализ — процесс, в котором через полупроницаемую
пленку (мембрану) могут проходить низкомолекулярные
вещества, а высокомолекулярные остаются. Путем
диализа осуществляют очистку вакцин и ферментов от
солей и низкомолекулярных растворимых примесей
1 – внутренний сосуд;
2 – полупроницаемая
мембрана;
3 – внешний сосуд

71.

При выборе метода концентрирования и выделения
биологического материала необходимо учитывать свойства
КЖ, свойства выделяемого продукта, требования к конечной
форме продукта, технологические и технико-экономические
показатели.
Если выделяемое вещество в КЖ находится в твердой
фазе, используют такие методы выделения и
концентрирования, как осаждение, фильтрование,
центрифугирование, сепарирование, а если в растворе экстракция, адсорбция, кристаллизация, диализ, упаривание.
62

72.

63