Половые различия функций фагоцитирующих клеток у крыс

1.

Половые различия функций
фагоцитирующих клеток у
крыс
Выпускная работа бакалавра
студентки 4 курса
Биологического факультета
очной формы обучения
Петуховой Анастасии Андреевны
Научный руководитель
к.м.н., доцент Шилов Юрий Иванович
Научный консультант
к.м.н., доцент кафедры
нормальной физиологии
ПГМУ им. академика Е.А. Вагнера

2.

Иcточник взят с сайта производителя : https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/gallery/high/Picture2-Green.jpg

3. pH-сенсетивные флуорохромы

pHrodo™ - вещество, химическая структура которого
основывается на семействе флуоресцентных красителей
родоминах*, разработан Life Technologies (Invitrogen).
Флуоресценция pHrodo™ резко возрастает в кислой среде. В
нейтральной среде (pH 7,0-7,4) флуресценции нет.
Существует множество коньюгатов с pHrodo для оценки
фагоцитоза (Escheriachia coli, Staphilococcus aureus, Zymosan
A-Sacchromyces cervisisae).
* Информация о химической структуре взята из статьи, стр.2722 :
Han, Junyan, and Kevin Burgess. "Fluorescent indicators for intracellular
pH."Chemical reviews 110.5 (2009): 2709-2728.
http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/cr900249z
http://www.b2b.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Molecular-Probes/Key-Molecular-Probes-Products/On-a-Cellular-Level.html

4.

Принцип использования pHrodo™
ФАГОЦИТОЗ
ЭНДОЦИТОЗ
источник взят с сайта производителя : https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/gallery/high/Picture2-Green.jpg

5.

Fluorescence Emission
Ex 532 nm
pH 4
pH 5
pH 6
pH 7
pH 8
pH 10
550 575 600 625 650 675 700
Wavelength (nm)
pHrodo™ RED
Fluorescence Emission
Зависимость интенсивности флуоресценции
pHrodo™ RED и pHrodo™ GREEN от pH среды
Ex 488 nm
pH 4
pH 5
pH 6
pH 7
pH 8
500 520 540 560 580 600 620 640 660
Wavelength (nm)
pHrodo™ GREEN
По данным сайта компании производителя www.lifetechnologies.com

6.

Цель работы – определение половых различий
фагоцитирующих клеток у крыс
• Задачи

7. Материалы и методы

Эксперимент
выполнен
на
30
нелинейных
белых
крысах разного пола
в
возрасте
4-7
месяцев,
разделенных на 3
экспериментальные
группы:
самцы,
самки в проэструсе и
самки в диэструсе.
источник взят с сайта : https://www.google.com/pictures151515151515.jpg

8. Определение фазы эстрального цикла

Кольпоцитологический анализ проводили согласно
общепринятому методу, описанному Я.М. Кабаком
(1968). Оценивали регулярность изменения фаз в
течение не менее двух циклов и отбирали животных
для эксперимента в фазы диэструса и проэструса.

9. Выделение лейкоцитов

Лейкоциты гепаринизированной (50
ЕД/мл) крови выделяли седиментацией
с 0,1% метилцеллюлозой (SigmaAldrich, США).
Перитонеальные
лейкоциты выделяли
промыванием брюшной
полости 10 мл среды
199 с 10 ЕД/мл
гепарина.
источник взят с сайта производителя : https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/gallery/high/Picture2-Green.jpg

10. Выделение лейкоцитов

Полученные
лейкоциты
дважды
отмывали
центрифугированием при 400 g в течение 10 мин.
После снятия супернатанта концентрацию клеток
доводили до 25*106 кл/мл добавлением ППС
(среда RPMI-1640 без L-глютамина с добавлением
2 мМ GlutaMax™, 1 мМ пирувата натрия, 1%
заменимых аминокислот в МЕМ (Gibco®, life
technologies™), 10 мМ HEPES (Sigma-Aldrich).
Источник взят с сайта производителя : https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/gallery/high/Picture2-Green.jpg

11.

Постановка фагоцитоза
4 мкл зимозана, меченого зелёным
pHrodo™ (100*106 частиц/мл;
pHrodo™ Green zymosan A
BioParticles® conjugate, Molecular
probes® by life technologies™,
P35365, Lot 1617699)
+ 4 мкл аутоплазмы
Преинкубация 30 мин при 37ºС
Инкубация 2 часа
+
4 мкл кл (в
конц.25*106кл/мл)
+ 88 мкл ППС*
Пробы перемешивали на VortexGenie-2
(Scientific Industries, США)
и инкубировали 120 мин при 37ºС.
* - среда RPMI-1640 без L-глютамина с добавлением 2 мМ GlutaMax™, 1
мМ пирувата натрия, 1% заменимых аминокислот в МЕМ (Gibco®, life
technologies™), 10 мМ HEPES (Sigma-Aldrich.
https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P35365

12.

Лизирование
+900 мкл лизирующего
раствора (0,15 М NH4Cl, 0,01 M
NaHCO3, 0,0001 M ЭДТА,
pH=7,2-7,4)
Источник взят с сайта производителя : https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/gallery/high/Picture2-Green.jpg

13.

Остановка фагоцитоза
После центрифугирования и снятия супернатанта клетки
дважды отмывали стоп-реагентом (0,1 объёма 0,5 М ЭДТА
+ 92,95 объёма забуференного 10 мМ HEPES
изотонического раствора NaCl) и доводили до объема 250
мкл стоп-реагентом и вносили в 96-луночный плоскодонный
планшет для ИФА («Медполимер», Санкт-Петербург).
Источник: Шилов С. Ю.

14. Прибор

Guava EasyCyte (Millipore)
Источник: www.millipore.com

15. Обработка результатов

Программное обеспечение «Guava Cytosoft 5.3»,
модули «Guava Express Plus/Pro».
Статистический анализ проводили методами
описательной статистики и непарного t-критерия
Стьюдента. Различия считали статистически
значимыми при р<0,05.
Источник: Шилов С. Ю. Рабочие листы программы Guava Cytosoft 5.3, модули Guava Express Plus/Pro

16. Кровь

Общее количество флуоресциирующих
событий (X – Arithmetic Mean)
Кровь
120
100
80
60
40
20
0
M
Самцы
(n=10)
35,977±1,47
F
Самки
(n=8)
93,363±13,198

17.

Общее количество флуоресциирующих
событий (X – Arithmetic Mean)
Перитонеальный смыв
300
250
200
150
100
50
0
M
Самцы
(n=10)
46,132±3,019
F
Самки
(n=8)
171,812±55,489

18. Результаты и обсуждение

• Неоднородность показателей в группе
самок связана, предположительно, с
физиологическими колебаниями
уровней гормонов в зависимости от
фазы эстрального цикла (10 самок
выборки на момент исследования
находились в фазе проэструса, 10 – в
фазе диэструса).

19.

• При оценке фагоцитарной активности лейкоцитов крови и
перитонеальных клеток крыс с использованием зимозана,
меченного флуорохромом – зелёным pHrodo™, отражающим
уровень ацидификации фагосом, установлено, что у самок
крыс в сравнении с самцами наблюдается более
интенсивное свечение поглощённых объектов и его более
выраженная вариабельность .
Источник взят с сайта производителя : https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/gallery/high/Picture2-Green.jpg

20. Выводы

• Исследованы половые различия фагоцитарной
активности лейкоцитов крови и перитонеальных
клеток у крыс с использованием зимозана,
меченного отражающим уровень ацидификации
фагосом флуорохромом – зелёным pHrodo™.
• Установлено, что у самок крыс в сравнении с
самцами наблюдается более интенсивная
флуоресценция поглощённых объектов.
• Помимо этого, показатели фагоцитоза у самок
характеризуются значительно большей
вариабельностью, нежели у самцов.

21.

ОЦЕНКА ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ
ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ КЛЕТОК И ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ
КРЫС С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МАРКЕРА
АЦИДИФИКАЦИИ ФАГОСОМ pHrodoTM
Шилов Станислав Юрьевич1, 2,
Жукова Анастасия Евгеньевна2,
Петухова Анастасия Андреевна3,
Барков Сергей Юрьевич2,
Шилов Юрий Иванович1,2,3
ФГБУН Институт экологии и генетики
микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь
1
ГБОУ ВПО «Пермский государственный
медицинский университет имени академика
Е.А. Вагнера» Минздрава России, г. Пермь,
2
ФГБОУ ВПО «Пермский государственный
национальный исследовательский университет»
3
Источник: Петухова А. А. Обложка Российского иммунологического журнала

22.

Спасибо за внимание!

23.

Спектры флуоресценции Extitaion/Emission pHrodo™ GREEN и pHrodo™ RED
pHrodo™ GREEN (Ex/Em=509/533 nm) в буфере pH=4
pHrodo™ RED (Ex/Em=560/585 nm) в буфере pH=4
По данным сайта компании производителя www.lifetechnologies.com

24. Фагоцитоз

Основной методической
проблемой при исследовании
фагоцитарной активности
лейкоцитов радиоизотопным,
флуориметрическим и
другими инструментальными
методами является сложность
отделения
нефагоцитированных меченых
объектов фагоцитоза от
поглощенных, которая
усугубляется их
агглютинацией при
взаимодействии с антителами
биологических жидкостей.
http://www.b2b.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Molecular-Probes/KeyMolecular-Probes-Products/On-a-Cellular-Level.html

25. Традиционные флуорохромы

Эта проблема частично
решилась при широком
внедрении проточной
лазерной цитометрии,
однако при использовании
традиционных
флуорохромов, например
флуоресцеинизотиоционат
а (ФИТЦ), в ходе
цитофлурометрического
исследования иногда
сложно отделить при
гейтировании
поглощенные объекты от
адгезированных к
фагоцитам.
http://www.b2b.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Molecular-Probes/KeyMolecular-Probes-Products/On-a-Cellular-Level.html