Диагностика наследственных болезней обмена веществ

1. Диагностика наследственных болезней обмена веществ

Захарова Е.Ю.
ФГБНУ МГНЦ

2. Биохимическая индивидуальность

3.

4.

Наследственные болезни обмена
веществ
Класс моногенных заболеваний
Большинство обусловлены
мутациями в генах
кодирующих ферменты
Известно около 700 нозологических форм
Редкие болезни, но суммарная частота НБО : 1:1000
Биохимические маркеры в десятки раз отличаются от
нормы
Выраженный клинический полиморфизм
Возможность метаболической коррекции для некоторых
форм

5.

Патогенез НБО
фермент 2
фермент 1
А
А1,А2
В
С
производные
субстрата
1. Субстрат или его производные в больших количествах
являются токсичными веществами
2. Недостаток продуктов реакции, необходимых для
определенных функций клетки
3. Субстраты или продукты влияют на скорость других реакций,
активируют определенные метаболические каскады

6. Принятие клинических решений

Stephen R Hayden, Michael D Brown
Likelihood Ratio: A Powerful Tool for Incorporating the Results of a Diagnostic Test Into Clinical Decisionmaking Annals of
Emergency Medicine, Volume 33, Issue 5, 1999, 575–580

7.

Генотип
ДНК -диагностика
Белок
Измерение активности
фермента
Определение белков
Биохимический
фенотип
Метаболиты
Анализ метаболитов
Клинический фенотип

8.

Идеальный клинический симптом
Высокоспецифичный для
каждой болезни
Известен и описан в доступной
литературе
Легко узнаваем врачом
Симптом = Жалоба

9.

Идеальный клинический симптом
Высокоспецифичный для
каждой болезни
Известен и описан в доступной
литературе
Легко узнаваем врачом
Симптом = Жалоба

10. Биомаркеры

• Биомаркеры – биологические молекулы,
различные по своей структуре и свойствам от простых метаболитов до сложных
макромолекул, отражающие
биологический процесс, связанный с
клиническими проявлениями заболевания

11.

Идеальный тест и биомаркер
•Высокочувствительный и
высокоспецифичный
•Полезен для мониторинга
терапии и прогноза течения
болезни
•Быстрый, дешевый тест
•Доступный во многих
лабораториях
•Один тест для нескольких
болезней
Presenter’s own opinion

12.

Идеальный тест и биомаркер
•Высокочувствительный и
высокоспецифичный
•Полезен для мониторинга
терапии и прогноза течения
болезни
•Быстрый, дешевый тест
•Доступный во многих
лабораториях
•Один тест для нескольких
болезней
Presenter’s own opinion

13. Чувствительность и специфичность теста

отрицательный положительный
Специфичность — это доля тех, у
которых тест отрицателен,
среди всех людей, не имеющих
болезни. Это мера вероятности
правильной
идентификации
людей, не имеющих болезни, с
помощью теста.
Заболевание:
Результат теста:
Чувствительность — это доля
действительно
болеющих,
которые по результатам теста
выявляются
как
больные.
Чувствительность — это мера
вероятности того, что любой
случай болезни (состояния) будет
идентифицирован
с
помощью
теста.
Есть
Нет
Истинно
положительный
(TP)
Ложно
положительный
(FP)
Ложно
отрицательный
(FN)
Истинно
отрицательный
(TN)
Se=TP/(TP+FN)
Sp=TN/(FP+TN)

14. Идеальная ситуация

Число тестов
25
20
Отрезная точка
15
больной
10
здоровый
5
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314

15. Реальная ситуация

Отрезная точка
Число тестов
25
20
15
10
Ложно
отрицательный
Ложно
положительный
Истинно
негативный
здоровый
Истинно
положительный
5
0
больной
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314

16. Биомаркеры при НБО

Первичные:
• Метаболиты (ГАГ при МПС,
аминокислоты при
аминоацидопатиях, галактоза при
галактоземии и тд)
• Специфический фермент
• Мутация в определенном гене
Вторичные
• Ферменты, которые «вторично»
повышаются при ЛБН (DPP-IV, ADA-1,
хитотриозидаза)
• TNF-α и другие маркеры воспаления
• Метаболиты (оксистеролы)
ADA, adenosine deaminase ; CSF, cerebrospinal fluid; DPP-IV, dipeptidyl peptidase; GAG, gylcosaminoglycans; IDS, iduronate-sulfatase; MPS, mucopolysaccharidosis;
TNF, tumour necrosis factor
Clarke LA et al. Mol Genet Metab 2012;106(4):395–402

17. Основные современные технологии детекции биомаркеров

• Масс-спектрометрия во всех ее
разновидностях для анализа белков и
метаболитов
• Современные технологии анализа ДНК
• Современные технологии анализа РНК
• Флюориметрические и
спектрофотометрические методы
определения активности ферментов и
концентрации метаболитов

18. Тандемная масс спектрометрия- современная технология диагностики НБО

Тандемная масс спектрометриясовременная технология диагностики НБО
% Intensity
100
• Позволяет
анализировать
большое число метаболитов,
а значит выявлять большое
число НБО
• Время
анализа
одного
образца- несколько минут
• Требуется
небольшое
количество
биологического
материала
(пятно
высушенной крови)
Pro
Ala
Phe
50
Leu + Ile
Leu
Gln
Val
Ala
Gly Ser Val
Gly
140
160
180
Phe
Cit
Met
Tyr
Tyr
Glu
AspGlu
200
m/z, 220
amu 240
260
280
300

19.

20. Тандемная-масс спектрометрия (аминокислоты и ацилкарнитины)

Аминоацидопатии
Лейциноз
(1:185 000)
ФКУ
(1:8000)
Тирозинемия тип 1 (1:100 000)
Некетотическая
Гиперглицинемия
(1:55 000)
Цитрулинемия
(1:250 0000)
Органические ацидурии
Глутаровая ацидурия тип 1 (1:30 000)
Пропионовая ацидемия
(1:50 000)
Метилмалоновая ацидурия (1:48 000)
Изовалериановая ацидурия (1:50 000)
Дефекты β-окисления
Недостаточность КЦАД
Недостаточность СЦАД (1:8000)
Недостаточность ОДЦАД
Недостаточность ДЦГАД
Другие дефекты β-окисления

21. Изменения аминокислот/ацилкарнитинов

Изменение концентрации
метаболитов
Лейцин/изолейцин ↑ валин ↑
Фенилаланин ↑
С10 ↑ С10:1 ↑ С6 ↑ С8 ↑
Заболевание
Болезнь с запахом кленового сиропа мочи (лейциноз)
Фенилкетонурия
Недостаточность среднецепочечной ацил-КоА
дегидрогеназы
С10:2 ↑
Недостаточность 2,4-диеноил КоА редуктазы
С14 ↑ С14:1 ↑ С14:2 ↑ С16:1 ↑ Недостаточность очень длинноцепочечной ацил-КоА
дегидрогеназы
С16OH ↑ С18ОН ↑ С18:1OH ↑ Недостаточность длинноцепочечной 3-гидроксиацил-КоА
С16:1OH ↑
дегидрогеназы (ДЦГАД)
С3DC ↑
Малоновая ацидемия
Изовалериановая ацидурия, недостаточность 2С5 ↑
метилбутирил КоА дегидрогеназы
Недостаточность 3-метилкротонил КоА карбоксилазы ,
С5ОН ↑
недостаточность биотинидазы и недостаточность
синтетазы голокарбоксилаз
Недостаточность митохондриальной ацетоацетил КоА
С5:1 ↑ С5ОН ↑
тиолазы
С5DC ↑
Глутаровая ацидемия тип 1

22.

Аминокислоты
100
контроль
Pro
ВНУТРЕННИЕ СТАНДАРТЫ
% Intensity
Ala
Phe
50
Leu + Ile
Phe
Leu
Tyr
Gln
Val
Ala
Gly
Gly
140
Ser
160
Val
180
Tyr
Glu
Cit
Met
200
220
m/z, amu
Asp
240
Glu
260
280
300

23.

Болезнь с запахом кленового сиропа мочи
100
Leu + Ile
% Intensity
ВНУТРЕННИЕ СТАНДАРТЫ
50
Val
Phe
Pro
Gln
Ala
Gly
Gly
140
Ala
Ser
160
Val
180
Leu
Phe
Cit
Met
200
220
m/z, amu
Tyr
Tyr
Asp
240
Glu
Glu
260
280
300

24. Лизосомные болезни накопления

• Обусловлены
мутациями
генов,
контролирующих
процесс
внутрилизосомного
гидролиза
макромолекул
• В зависимости от
накапливаемых
субстратов разделяют на несколько
подклассов
• Число известных форм – около 50
• Наследуются
по
аутосомнорецессивному типу (кроме болезни
Фабри, болезни Хантера, болезни
Данон)
• Частота ЛБН в популяции 1:5000 – 1:8000

25. Электрофорез ГАГ мочи

ХС
ДС
ДС
ГС
MПС VI
MПС III
стандарт
МПС II
стандарт

26. Электрофорез ГАГ мочи

ХС
ДС
ДС
ГС
MПС VI
MПС III
стандарт
МПС II
стандарт

27.

LC-MS/MS для анализа ГАГ в моче
Langereis EJ, et al. (2015)A Multiplex Assay for the Diagnosis of Mucopolysaccharidoses
and Mucolipidoses. PLoS ONE 10(9): e0138622. doi:10.1371/journal.pone.0138622

28.

Определение активности лизосомных
ферментов – «классический вариант»
•Активность лизосомных ферментов с помощью доступных искусственных
флюорогенных или хромогенных субстратов можно определить в
лейкоцитах, фибробластах, плазме крови.
•При пересылке образцов крови на большие расстояния активность
ферментов может снижаться- ЛОЖНОПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ!

29.

Определение активности лизосомных
ферментов – «классический вариант»
•Активность лизосомных ферментов с помощью доступных искусственных
флюорогенных или хромогенных субстратов можно определить в
лейкоцитах, фибробластах, плазме крови.
•При пересылке образцов крови на большие расстояния активность
ферментов может снижаться- ЛОЖНОПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ!

30. Активность ферментов в пятнах высушенной крови

• Многие лизосомные ферменты сохраняют
свою активность в пятнах высушенной крови
• Определение активности ферментов в пятнах
крови возможно применять для селективного
скрининга на ЛБН
• Два основных метода- флуориметрическое
определение активности ферментов и с
помощью тандемной масс-спектрометрии

31. Флюорогенные субстраты

Искусственный
субстрат
фермент
МУФ
МУФ
Высокая
флуоресценциянормальная активность
фермента
низкая флуоресценциянизкая активность
фермента

32. Определение активности ферментов в пятнах крови: флуориметирия

калибровка MU
Субстрат + пятно крови
бланк

33. Один тест- несколько заболеваний

• Тандемная МС позволяет
применять натуральные
субстраты или из близкие
аналоги для определения
активности ферментов
• Возможно определять в
одном анализе активность
нескольких ферментов
одновременно

34. Шесть зферментов – один анализ

образец
экстракция
субстрат
Жидкостная
экстракция
инкубация
высушивание
МС/МС анализ
элюирование
Твердофазная
экстракция

35. Девять ферментов и это только начало….

36. Вторичные биомаркеры

Массовый скрининг
Текущая диагностика
Селективный скрининг
Контроль лечения
Понимание патогенеза заболеваний

37. Хитотриозидаза

• Повышается при
некоторых ЛБН
• При болезни Гоше в 1000 раз
• Полиморфный
вариант в гене
хитотриозидазы
делает маркер
неинформативным
у 10-15%

38. Сфинголипидозы

Группа ЛБН,
обусловлененных
нарушением
одной
из стадий
деградации
сфинголипидов

39. Cфиноголипиды в роли биомаркеров

• Глоботриазилсфингозин (lyso-Gb3) при
болезни Фабри
• Гликозилсфингозин (lyso-GL-1) при болезни
Гоше
• Галактозилсфингозин при болезни Краббе
• Лизосфингомиелин- 509 (Lyso-SM-509) при
болезни Ниманна-Пика тип А, В, С

40.

Сфинголипидозы
50,0
500,0
GlcSph+GalSph, нг/мл
50,0
LysoGb3, нг/мл
5,0
5,0
0,5
0,5
контроль
Фабри
НПС
НПА/В
Гоше
Краббе
контроль
Фабри
НПС
НПА/В
Гоше
Краббе
НПА/В
Гоше
Краббе
120
50,0
100
Lyso509, MOM
lysoSM, нг/мл
80
60
5,0
40
0,5
20
0
контроль
Фабри
НПС
НПА/В
Гоше
Краббе
контроль
Фабри
НПС

41.

42. Гликосфингозин (Glucosylsphingosine)

43. ДНК-диагностика

• Простой
и
быстрый
анализ
(выявление определенной, обычно
частой мутации в гене)
• Более сложный анализ (для поиска
редких мутаций)
• Полное
геномное/экзомное
секвенирование

44.

Секвенирование нового поколения
(NGS)
Задачи
• Исследования
• Диагностика
Подходы
• Полное геномное секвенирование (WGS)
• Полное экзомное секвенирование (WES)
• Панели генов (GP)

45. Нарушения биогенеза пероксисом - уроки применения секвенирования нового поколения

46. Экзомное/геномное секвенирование

• «Это так здорово – один,
пусть
и
дорогостоящий
анализ, но я узнаю точный
диагноз!»
• «Замечательно! Мы все
будем знать о геноме своего
пациента– обо всех болезнях,
предрасположенностях
к
заболеваниям.»
• «Наконец-то,
после
проведения такого сложного
анализа
будем
лечить
правильно!»

47.

Экзомное/геномное
секвенирование
• «Это так здорово – один,
пусть
и
дорогостоящий
анализ, но я узнаю точный
диагноз!»
• «Замечательно! Мы все
будем знать о геноме своего
пациента– обо всех болезнях,
предрасположенностях
к
заболеваниям.»
• «Наконец-то,
после
проведения такого сложного
анализа
будем
лечить
правильно!»

48. Точечные мутации – с учетом воздействия на белок

Молчащие мутации/варианты
– Например AGC (Ser) > AGT (Ser)
– Могут быть редкими полиморфизмамим
– Могут быть патогенными (например оказывать
влияние на сплайсинг)
Миссенс - мутации/варианты
– Например CCC (Pro) > CAC (Ser)
– Ведет к замене аминокислот
– Возможны непатогенные варианты либо патогенные
мутации
Мутации участка сплайсинга
– Ведет к нарушениям сплайсинга
– Могут не оказывать влияния на сплайсинг
Вероятность
повреждений
По материалам презентации Dr. Michael Zeschnigk
Нонсенс - мутации
– Например, TAC (Tyr) > TAA (STOP, X, Ter*)
– Приводят к преждевременному «обрыву цепи»
– В редких случаях могут быть вариантами нормы

49. Диагностика НБО

• Биохимические маркеры необходимы как
для первичной диагностики, так и для
«функциональной» проверки вариантов,
найденных при секвенировании генов
• В первую очередь необходимо исключать
болезни для которых существует лечение
• Сочетание биохимических и молекулярногенетических тестов позволяет повысить
точность диагностики НБО

50.

« all medicine is genetics»
Victor A. McKusick
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!