Мегагаметофит-2. Транскрипционная активность клеток женского гаметофита

1. Мегагаметофит-2

2. Транскрипционная активность клеток женского гаметофита

• На начальном этапе в зародышевом мешке все ядра
транскрипционно активны в равной мере.
• По мере созревания женского гаметофита
транскрипционная активность яйцеклетки
уменьшалась, достигая минимума в прогамной фазе.
• Содержание в яйцеклетке поли(А)РНК также было
исчезающе мало. Это означает, что яйцеклетка не
накапливает транскрипты впрок.
• Синергиды и антиподы в зрелом зародышевом мешке
гиацинта транскрипционно активны и мало отличаются
по этому признаку от соматических клеток.

3. Ядро яйцеклетки

• В исследованиях
ультраструктуры
яйцеклеток различных
видов растений их
ядра описаны как
деконденсированные.
• Деконденсированное
состояние хроматина
транскрипционно
неактивных
яйцеклеток связывают
с подготовкой
ядерного материала к
слиянию гамет.
• По состоянию
хроматина синергиды
и антиподы ближе к
соматическим
клеткам, чем к
гаметам.
RNA Pol II pool (4H8 antibodies)
Ядро яйцеклетки
Ядро соматической клетки

4. Диморфизм женских гамет

• Перед оплодотворением в ЦК и ЯК
разный уровень активности РНК
полимеразы II: она присутствует в
заметных количествах в ЦК и
практически не выявляется в ядре
яйцеклетки
• При этом на начальных этапах
созревания ЗМ эти клетки не
различаются.
• Разный эпигенетический статус
двух женских гамет: в ЦК
хроматин более
деконденсированный
• Маркеры гетерохроматина –
гистоны во время созревания
практически исчезают в ЦК. В то
же время в ядре ЯК сохраняются
отчетливые очаги с высоким
содержанием маркеров.

5. Вспомним, что…

• Структуру хроматина и его
транскрипционную способность в
клетках растений и животных
детерминируют процессы
модификации гистонов и
метилирования ДНК
• В обеих женских гаметах Arabidopsis, как и в спермиях, отсутствует
большинство канонических соматических вариантов гистона H3. В ЯК
выявляется только HTR5, а в ЦК – HTR3,HTR8 и HTR14.
• Анализ ядра зиготы Arabidopsis показал, что вскоре после оплодотворения из
хроматина удаляются отцовские и материнские варианты гистона H3.
• Вслед за этим начинается синтез H3 de novo и формируется набор вариантов
этого гистона, характерный для соматических клеток. Эти процессы
свидетельствуют о возможном репрограммировании генома зиготы с целью
ограничить передачу потомству эпигенетической информации.

6. Диморфизм. Эпигенетика.

• Две женские гаметы различаются по уровню экспрессии
генов, контролирующих уровень метилирования ДНК.
Метилирование ДНК осуществляют метилтрансферазы,
деметилирование – ДНК-гликозилазы.
• В ЦК, как и в синергидах, практически отсутствовали
транскрипты метилтрансфераз и активно экспрессировались
ДНК-гликозилазы.
• В ЯК соотношение транскриптов было обратным.
active transcription of transposable elements (TEs).

7. Диморфизм. Эпигенетика. Зачем?

• Дифференциальная экспрессия этих ферментов, а также
метилирование генома зародыша и эндосперма указывают на
то, что центральная клетка «глобально» деметилирована по
сравнению с яйцеклеткой. Прямые данные пока отсутствуют.
• Зачем же это нужно? Одна из гипотез гласит, что мобильные
малые РНК, образовавшиеся в центральной клетке, могут
замалчивать определенные гены (транспозоны) в яйцеклетке и
позже в зиготе, тем самым обеспечивая стабильность
генетической информации, передаваемой потомству.

8. Встреча полов

9. Адгезия пыльцевых зерен на сухом рыльце

• Сухое рыльце поверх кутикулы покрыто
белковым слоем – пелликулой. После
попадания пыльцы на рыльце сначала
происходит ее адгезия и узнавание, и лишь
затем может начаться гидратация.
• Если бы площадь контакта составляла 0,10,5 м2, то адгезия была бы достаточно
сильной, чтобы удержать на весу 100-кг
объект
• При межродовом опылении (Brassica х A.
thaliana) пыльца прикреплялась слабо, при
внутривидовом опылении – гораздо
сильнее. Это указывает на специфичность
взаимодействия между пыльцой и сухим
рыльцем уже при первом их контакте.
• Прочность прикрепления пыльцы к
поверхности рыльца Brassica постепенно
возрастала, достигая максимума примерно
через 30 мин

10. На первом этапе - экзина

• Экзина является одним из главных
факторов, влияющих на
прикрепление пыльцы Arabidopsis к
рыльцу
• Выделенная экзина не теряет
способности прикрепляться
• Мутанты с дефектной экзиной не
могут прикрепляться
• Постепенное усиление
взаимодействия между пыльцевым
зерном и папиллой рыльца требует
участия поверхностных белков и
липидов обеих сторон.
• Со стороны пыльцевого зерна – это
компоненты трифины, со стороны
рыльца – белки пелликулы.

11. Основание… foot

• Белки и липиды трифины и
пелликулы объединяются и
образуют зону контакта –
«основание» (foot), на котором
развиваются процессы узнавания
и, в случае совместимого
опыления, происходит
гидратация пыльцевого зерна.
• В ходе этого процесса
папиллярная клетка активно
транспортирует через зону
контакта не только воду, но и
кальций, бор и другие
необходимые для запуска
активации компоненты.

12. На втором этапе - трифина

• Ключевая роль липидов в
гидратации пыльцы Arabidopsis
была показана в экспериментах с
мутантами eceriferum (cer), у
которых нарушен синтез
длинноцепочечных липидов и
практически отсутствует трифина;
такая пыльца стерильна.
• Этот дефект был полностью
компенсирован, если опыление
происходило при высокой
влажности или после добавления
на рыльце очищенных
триглицеридов.

13. Адгезия пыльцевых зёрен на влажном рыльце

• Рыльцевый экссудат по своему
составу может быть
преимущественно липидным
(Solanaceae) или водным с большим
содержанием углеводов (Liliaceae).
• Во всех случаях в составе экссудата
имеются вода, углеводы – простые и
сложные, жирные кислоты, белки и
фенольные соединения.
• Удержание и адгезия пыльцы на
влажном рыльце осуществляются за
счет вязкости и поверхностного
натяжения экссудата.
• На таком рыльце может
гидратироваться и прорастать даже
пыльца других видов.
олива
лилия

14.

Значение экссудата
Безрыльцевый пестик табака.
Аппликация РЭ петунии
Аппликация ненасыщенных
триглицеридов
©2004 by American Society of Plant Biologists
Аппликация РЭ лилии
Аппликация насыщенных
триглицеридов
Ana Maria Sanchez et al. Plant Cell 2004;16:S98-S106

15. Ещё про экссудат

• Экссудат синтезируется и
секретируется
специализированными
секреторными клетками
поверхности рыльца.
• Он может скапливаться на рыльце в
кратере, как у некоторых бобовых,
или располагаться на поверхности
купола, как у лилии.
• Экссудат у Solanaceae двухфазный:
гидрофобная фаза (верхний слой)
обогащена липидами, а под ней
располагается гидрофильная фаза –
очень тонкий водный слой.
Пыльцевое зерно проваливается
сквозь верхний слой и устанавливает
непосредственный контакт с
клетками рыльца.

16. Белки экссудата

Белки экссудата проявляют заметную катаболическую способность.

17. Белки экссудата

• Самую крупную группу белков в экссудате лилии составляют Oгликозилгидролазы. Их мишенью могут быть арабиногалактановые белки
и пектины – главные компоненты экссудата. Это позволяет говорить о
важной роли полисахаридного катаболизма в снабжении прорастающей
пыльцы питательными веществами.
• Вторую группу гидролаз составляют протеолитические ферменты, которые
могут участвовать в процессах адгезии и узнавания пыльцы на рыльце.
• Третью группу гидролаз образуют липазы, которые могут участвовать в
гидратации пыльцы, модифицируя состав липидов на границе трифины
пыльцевого зерна и рыльцевого экссудата.
• В экссудате обнаружены также хорошо известные компоненты сигнальных
систем – рецептор-подобные киназы (лилия и олива) и 14-3-3- белок
(олива).

18. Защита от АФК

• Рыльцевый экссудат - источник воды для регидратации
пыльцы и создает для нее питательную среду.
• Вместе с тем важная функция рыльцевого экссудата –
защита прорастающей пыльцы от активных форм
кислорода (АФК).
• Методом ЭПР выявили высокую антиоксидантную
способность рыльцевого экссудата Lilium longiflorum и
Nicotiana tabacum.
• В качества антиоксидантов в данном случае могут
выступать Cu/Zn-супероксиддисмутазы и пероксидазы,
обнаруженные в экссудате L. longiflorum в ходе
протеомного, а также фенольныесоединения.

19. Растите, мы вас ждём!

• Прорастание пыльцы на рыльце
пестика и рост пыльцевой
трубки in vivo контролируется
клетками спорофита и женского
гаметофита.
• Они могут способствовать
движению гамет к яйцеклетке
или, наоборот, препятствовать
этому, предотвращая
полиспермию или прорастание
несовместимой пыльцы.
• В конечном итоге выбор – за
женщиной… или за женским
гаметофитом.

20. Как наблюдать прорастание in vivo?

• Раньше – на скучных срезах
фиксированных препаратов.
• Теперь – с помощью
интравитальной двухфотонной
микроскопии.
• За счет длинноволнового
возбуждения флуорофоров в
двухфотонной микроскопии
обеспечивается глубокое
проникновение лазерного луча в
толщу тканей и высокое
разрешение глубинных оптических
срезов, недоступное
традиционным методам.
Alice Y. Cheung et al. J. Exp. Bot. 2010;61:1907-1915

21. Проникновение в святую святых

• Пыльца прорастала на рыльце синхронно.
• Пыльцевая трубка выходила через
апертуру, ближайшую к папилле рыльца.
• Вначале она росла вдоль папиллы и затем
врастала в проводниковую ткань пестика.
Скорость роста пыльцевой трубки на
поверхности рыльца составляла около 6
мкм/мин, эта фаза продолжалась около
часа.
• Путь в столбике занимал 2,5-3 ч, скорость
роста на этом этапе была примерно в два
раза ниже.
• Пыльцевая трубка, вошедшая в завязь,
несколько раз меняла направление своего
роста, отыскивая вход в семяпочку. Но
следующая за ней трубка проходила мимо
этой уже занятой семяпочки, не
отклоняясь.
• По-видимому, такая семяпочка
Alice Y. Cheung et al. J. Exp. Bot. 2010;61:1907-1915
прекращает аттракцию новых пыльцевых
трубок и/или блокирует их приближение.

22. Вспоминаем: пектины важны для механики…

• Важную роль в регуляции прорастания пыльцы и
роста пыльцевой трубки играет модификация
пектинов. Гомогалактуронаны синтезируются в
аппарате Гольджи и поступают в клеточную стенку в
высокометилированной форме. Здесь может
происходить их деэтерификация с помощью
пектинметилэстераз.
• При этом открываются карбоксильные группы,
способные связывать Ca2+. Он сшивает соседние
молекулы, образуя пектатный гель. Тем самым
снижается пластичность клеточной стенки, она
становится более жесткой.

23. Но не только…

• Модификация пектинов
нужна не только для
изменения механических
свойств клеточной стенки.
• У покрытосеменных
растений
низкоэтерифицированные
пектины участвуют в
процессе адгезии
пыльцевой трубки к
проводниковой ткани
столбика!

24. Что нужно, чтобы приклеиться?

• Компоненты внеклеточного матрикса,
извлеченного из столбика, наносили на
нитроцеллюлозную мембрану. Когда
такую мембрану помещали в чашку с
суспензией проросшей пыльцы,
пыльцевые трубки, прилипшие к
поверхности мембраны, ускоряли свой
рост.
• Адгезивные свойства внеклеточного
матрикса в этих условиях проявлялись
при наличии двух компонентов: пектина
и небольшого (9 кДа) цистеин-богатого
белка адгезина (SCA, Stigma/stylar
Cysteine-rich Adhesion).
• Этот белок связывается, с одной
стороны, с пектином матрикса, а, с
другой стороны – с неизвестным
партнером в стенке трубки (возможно,
это также пектин).

25. Transmitting Tissue-Specific

• В проводниковой ткани столбика табака найден гликопротеин TTS
(Transmitting Tissue-Specific), локализованный во внеклеточном
матриксе.
• Показано, что этот белок стимулирует рост трубки in vitro и in vivo и
аттрагирует трубки в культуре semi in vivo.
• У трансгенных растений со сниженным уровнем белков TTS пыльцевые
трубки растут медленнее.
• Степень гликозилирования белка TTS возрастает по мере приближения
к нижнему концу столбика, т.е. он формирует углеводный градиент.
• Более того, пыльцевые трубки секретируют гликозилазы, которые
дегликозилируют TTS, тем самым снабжая их углеводами для питания
• TTS – арабиногалактановый белок.

26. Распределение АГБ (промоторный анализ с GFP и GUS)

• Описана картина
дифференциальной
экспрессии ряда
арабиногалактановых
белков на всем пути
следования
пыльцевой трубки.
• AGP1 экспрессируется
в клетках рыльца и
проводниковой ткани
столбика, а
• AGP15 – во всех
тканях столбика,
кроме
проводниковой.
• AGP23 приурочен к
мужскому
гаметофиту.

27. Сигнал или еда?

Локализация транскриптов показана методом FISH-гибридизации (Pereira et al., 2015)
• Белки внеклеточного матрикса служат в качестве аттрагирующего,
адгезивного и/или питательного субстрата для растущей
пыльцевой трубки.
• Проводниковая ткань пестика обеспечивает питание пыльцевой
трубки и контролирует скорость и направление ее роста.
• Более того, рост в окружении тканей пестика может изменять
физиологию пыльцевой трубки.

28.

Хемоцианин – настоящий афродизиак
Видовая специфичность
Sunran Kim et al. PNAS 2003;100:16125-16130
©2003 by National Academy of Sciences
Plant Signaling & Behavior 8:10, e25682; October 2013

29. «Приручение» мужского гаметофита

• Трубка Torenia fournieri во время роста
в столбике приобретала способность
реагировать на поздние аттрактанты:
трубки, растущие in vitro, становились
компетентными к действию
аттрактантов лишь после того, как они
прорастали сквозь экспланты пестика.
• Таким образом, контактируя с
проводниковой тканью, пыльцевая
трубка научилась узнавать сигналы,
подаваемые женским гаметофитом.
• Растущая пыльцевая трубка, в свою
очередь, выделяет вещества,
модулирующие внеклеточный
матрикс, например,
полигалактуроназы и ингибиторы
пектинметилэстераз.

30. После опыления пестик тоже меняется

• Опыление индуцирует в пестике
разнообразные процессы, затрагивающие как
ткани спорофита, так и женский гаметофит.
• Подготовка встречи гамет и оплодотворения
• Запуск старения органов цветка (накопление
этилена)
• Опыление активирует экспрессию генов АЦКсинтазы и АЦК-оксидазы, контролирующих
биосинтез этилена

31. Для чего нужен этилен в пестике?

• У орхидных мРНК АЦК-оксидазы
накапливается во всех клетках пестика, у
табака и петунии – преимущественно в
проводниковой ткани.
• Пока не похоже, что этот гормон
необходим для оплодотворения.
Ингибирование синтеза или действия
этилена не влияет на рост пыльцевых
трубок табака. Нечувствительные к
этилену мутанты Arabidopsis и табака
сохраняют фертильность.
• Как полагают, накопление этилена
должно подготовить развитие плодов и
семян.
• Мутанты по восприятию этиленового
сигнала демонстрируют временной
сдвиг запуска старения пестика.
Нет этилена
Конст.ответ на этилен

32. Потенциал действия в пестике?!

• Природа сигналов, опосредующих влияние
мужского гаметофита на состояние тканей и
клеток пестика, может быть как химической,
так и электрической.
• Опыление индуцировало серию из 10-15
потенциалов действия, которые стимулировали
временную активацию дыхания завязи.

33. Специфичность электрического сигнала

Потенциалы действия возникали через 50-100 с после опыления, а
активация дыхания – через 3-5 мин.
Поскольку меченый ауксин проходит путь от рыльца до завязи
Hibiscus примерно за 45 мин, очевидно, что в данном случае
сработал электрический сигнал.

34. Ближний сигнал

• Трихома рыльца реагирует на контакт с пыльцевым зерном
локальным увеличением внутриклеточной концентрации Ca2+.
• Этот эффект проявлялся через 40-140 с после опыления и был
связан с гидратацией пыльцевого зерна.
• Однако при замене пыльцы на песчинку концентрация Ca2+ в
трихоме не изменялась.
• Кальциевый сигналинг запускался только при условии гидратации
пыльцевого зерна и, по-видимому, опосредовал ближние
взаимодействия между пылинкой и трихомой.

35. ПД в трихоме и нуцеллусе

• Через 3-5 мин после опыления
возникала серия спайков
(потенциалов действия) в
проводниковой ткани пестика и, с
небольшой задержкой, в
нуцеллусе семяпочки.
• Аналогичные изменения
электрического потенциала
происходили, если вместо
пыльцевого зерна использовали
кварцевую песчинку.
• Таким образом, электрический
сигнал возникал в ответ на
механический стимул и
опосредовал дальние
взаимодействия.
пыльца
песчинка