Определение естественных регуляторных Т-клеток

1. Определение естественных регуляторных Т-клеток.

Подготовил: студент группы 3.4.01.
Дьяконов А. С.

2.

• Как и следует из названия, регуляторные Т-лимфоциты (Treg) клетки, выполняющие функции регулировщиков, или
супрессоров, по отношению к другим клетками иммунной
системы. Treg контролируют иммунный ответ на чужеродные и
аутоантигены и предотвращают развитие аутоиммунных
процессов.
• Известны по крайней мере два варианта регуляторных Т- клеток:
-Естественные (природные- natural), спонтанно развивающиеся в
тимусе клетки (Тreg).
-Адаптивные, формирующиеся на периферии (индуцированные)
(Th3- и Tr1-клетки).
Все эти клетки происходят из СD4+ T-лимфоцитов.

3.

4.

Существуют 3 группы подходов к определению и характеристике
естественных Treg.
1. Цитофлуорометрическое выявление экспрессии мембранных
антигенов (CD4, CD25, CTLA-4)
2. Оценка экспрессии гена FOXP3.
3. Оценка функциональной активности Тreg.
Только комбинация всех трех подходов дает реальную
информацию о состоянии субпопуляции Тreg.

5. Цитофлуорометрическое определение Treg

• Метод основан на определении комбинации антигенов,
характерных для Тreg, методом проточной цитометрии с
помощью моноклональных антител, меченых флуорохромами.
• Выявляют CD4, CD25, CTLA-4 (CD152)
• Причем учитываются только клетки с высоким уровнем
экспрессии CD25
• Иногда в тест систему включается определение CD127 (не
экспрессируется на Treg)

6.

7.

8. Нормативы.

• Содержание клеток с мембранным фенотипом CD4+ CD25+ в
периферической крови составляет 2-3,5% от числа
мононуклеаров, или 35- 100 клеток в 1 мкл.

9. Определение экспрессии гена FOXP3 с помощью Real Time ПЦР.

10.

11.

12. Оценка функции естественных регуляторных Т-клеток

• Выделение Treg при помощи магнитных бус.
1) Отрицательная селекция CD4+
2) Положительная селекция СD25+
• Тест с подавлением пролиферативного ответа на стимуляцию
клеток CD4+CD25-

13. Методика постановки теста

• Активация клеток CD4+CD25- моноклональными антителами к
CD3 (фиксир. на пластинке)
• Культивирование 12ч при +4
• + смесь растворимых антител к CD28 и IL-2(рекомбинантный)
+ сингенные мононуклеары (АГ предст. Клетки)
• Культивирование 60 часов при 37
• Добавление 40кБк Тиминина
• Культивирование 12 часов
• Сбор данных

14. Методы оценки апоптоза.

15.

Апоптоз- один из двух путей клеточной гибели. Он представляет
собой гибель клетки, обусловленную нарушением условий
существования или прямым повреждающим действием внешних
факторов, является активной формой гибели клетки, обусловлена
включением через сигнальные пути механизмов, приводящих к
деградации генетического материала и истощении энергетических
ресурсов.
Различают: внутренний (митохондриальный ) и рецепторный.

16.

Роль апоптоза в иммунной системе состоит в контроле
численности клеток, клонального состава популяций лимфоцитов,
а так же в повышении сродства В- лимфоцитов, а следовательно, и
антител к антигену и в ограничении продолжительности
иммунного ответа.
• Формирования разрывов ДНК
• Деградация и потеря клеткой части ДНК
• Асимметрия мембраны с экспрессией на поверхности необычных
молекул
• Изменения морфологии клетки

17. Методы оценки:

• Морфологический
• Электрофоретический метод
• TUNEL- метод
• По связыванию аннексина V и окрашиваемости пропидия
йодидом
• Регистрация потери ДНК в тесте с применением пропидия йодида

18. Метод оценки клеточной гибели по связыванию аннексина и окрашиваемости пропидия йодидом

• Принцип: определение экспрессии фосфатидилсерина,
появляющегося на поверхности клетки вследствие нарушения
асимметрии мембраны в процессе апоптоза, с помощью
аннексина V (обладающего сродством к фосфатидилсерину),
меченного флуорохромом.
• Параллельно определяют некроз клеток, регистрируя появление
проницаемости для пропидия йодида, связывающегося с ДНК
клетки.
• Нередко комбинируют с определением субпопуляционной
принадлежности.

19.

20.

21. Спасибо за внимание.