Полимеразная цепная реакция

1.

Полимеразная цепная реакция
(ПЦР)

2.

GGTTCTCGTCGTGTGCACTGCCTCGCCTCGGGGGTGAGAGAGCCTGCTGATCTTCGCCGATTCCTTCCTTGGCAATGGCA
TCTTCATTCCGAGCAGCCTCGCACTGCATCCCCGTCTCTGCTCCCGCTTCTGCGTTTCCAACGAACCCCTTCTTGTTGCGTT
CGGCGCCCATTTGGTCTGGTTTCGGTGGCCTTAGGGTTGGCGTTGAGAATGGTGGGAGTGAGGCGGTGCATCGCCCTCC
ACATGCTGGATGTGGATTAGGCGTGAGGGCTGGAGCTGGTCGAGTCGATAGAGGAGGAGGCCGTGAAGTTGTGTATGG
TTTGTTAGGTCGTCGTGCGGGTGAGAGCAGGAGGGGAAAAGCTGGTGCAGCGTTGCTGCGGGATTTCGGTTCGTCGCG
GGGGCGTGTCTTGACTGCTGCCATGACGGATAATATGAAGAATTTGAACCTGGATGACGACAAGTCTGTCAATGGTGACG
TCGCCGAAAAGGTGATTGTGTCTTTTGACTGGTTGCTAGTGGTATTGGTGTTGAATCTTCGTGATTCTTCTTTTTGTTCGAC
TAGCGAATAGTTCGAATGTGAGTTTCTTCTTCTTCCTCCTCTTCTTCTTCTTGTGCTTCTTCTCGGGCTTGAAGGTATCGCGA
GTATTAGCCTTCGCATTGATTTGAATTATGTGAACGAGAGCTATGAGATTGTGTAGTAAGGAGTAAATGGCAAGGATGCTG
TGTGCGATGCGGCTGAATGAAATTGTCAGCACACAGAAAAAACACGTGGAAGTATTTGAATAAGACAACGTAATAGAAG
TTGCTCCACGTTAAATTGACAGGTTAATTCCGTTGGTTTTGCGATAGTATGCTGTGTTATCGTTTCAGACTAAAACATGACG
TGTTGTTGGTTTGAACTGCTGTAGTTAGTTTTGCATTTGATAAATTGCTGAGTCTTACAGCACTGATTTGTTTGTCTTGTTAC
ATTCAAACTCCGTCTCTCCTATGGCATGAAGCTGGTTAATCGATTGTATTCCTAATGTTGAGTGTAACTAGGGTTTGACATTG
ACAAGCTTAGTCTCACATCATTAAAGAATCGGCGTGAATAGCACTTAAGAACATCATCAAAATTAGGAATTCACCTCCGACT
GAAGTTGAATGATTAGATATAAAATAATAAATAATAATAAATAATAAAAAAAACTAAAAAAACTAAATTAACAGGATTAGCA
CACGCAATAACTTAATCAAAGTCTTCCCAGACTCGAACGTGTGCATCTTGAACTTAGTTCTGATTTACTAGGTTGTTTCTGC
TAGATTGTCAGTCGAAAATATGCTAGGAATATTTCGAGCTTAAAAGAGTTCTCAAAAGTTTCATGTTCAGTCTCCATGTTTT
AAGCTTGTATTCCTGTGATTTTTCTCTAAGTTTCCCGTTGATGGCGTAGAACGATTAGGGTAAGAAATGATTATGCAACTGA
AACTTGGCTGGTTTGAACTGCTGTAGTTAGTTTTGCATTTGATAAATTGCTGAGTCTTACAGCACTGATTTGTTTGTCTTGT
TACATTCAAACTCCGTCTCTCCTATGGCATGAAGCTGGTTAATCGATTGTATTCCTAATGTTGAGTGTAACTAGGGTTTGACA
TTGACAAGCTTAGTCTCACATCATTAAAGAATCGGCGTGAATAGCACTTAAGAACATCATCAAAATTAGGAATTCACCTCCG
ACTGAAGTTGAATGATTAGATATAAAATAATAAATAATAATAAATAATAAAAAAAACTAAAAAAACTAAATTAACAGGATTAG
CACACGCAATAACTTAATCAAAGTCTTCCCAGACTCGAACGTGTGCATCTTGAACTTAGTTCTGATTTACTAGGTTGTTTCT
GCTAGATTGTCAGTCGAAAATATGCTAGGAATATTTCGAGCTTAAAAGAGTTCTCAAAAGTTTCATGTTCAGTCTCCATGTT
TTAAGCTTGTATTCCTGTGATTTTTCTCTAAGTTTCCCGTTGATGGCGTAGAACGATTAGGGTAAGAAATGATTATGCAACT
GAAACTTGGCTGGTTTGAACTGCTGTAGTTAGTTTTGCATTTGATAAATTGCTGAGTCTTACAGCACTGATTTGTTTGTCTT

3. Кэри Маллис

американский биохимик,
лауреат Нобелевской премии
по химии в 1993 году
Родился 28 декабря 1944
года в г. Ленуар
Родители – фермер Сэсил
Бэнкс Маллис и Бернис
Альберта.
В детстве Маллис мастерил
и запускал самодельные
ракеты,
экспериментировал с
химическими веществами.

4.

Репликация (удвоение) ДНК

5.

Репликация (удвоение) ДНК

6.

Полимеразная Цепная Реакция

7.

Полимеразная Цепная Реакция
метод получения множества копий
определенных фрагментов ДНК
Размножение участка ДНК
1 099 511 627 766

8.

Полимеразная Цепная Реакция

9.

Полимеразная Цепная Реакция
Размножение участка ДНК
1 000 000 000 000

10.

Детекция результатов ПЦР
Электрофорез – разделение молекул по размеру

11.

Электрофорез – разделение молекул по размеру

12.

Детекция результатов ПЦР
1500
1400
1300
1200

13.

Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Область
Цель
Примеры
медицина,
ветеринария
Детекция
возбудителей
болезней
Вирусы гриппа, оспы,
гепатита, бешенства, ВИЧ и
др.
Диагностика
Гемофилия, муковисцидоз,
наследственных фенилкетонурия
заболеваний
агробиологии Поиск полезных Высокое содержание
(вредных) генов питательных веществ,
устойчивость к болезням и
вредителям и мн. др.
Диагностика
возбудителей
болезней
Вирус Х картофеля, серая
гниль, фузариоз, фитофтороз
криминалист
ика
Идентификация
личностей
Полиморфные локусы ДНК
история,
археологии
Идентификация
биологических
останков
Полиморфные локусы ДНК,
рРНК и др.

14.

Состав ПЦР-смеси

15. Детекция результатов ПЦР

16.

Основные компоненты ПЦР и факторы, которые оказывают влияние на
результативность процесса

17.

Основные компоненты ПЦР и факторы, которые оказывают влияние на
результативность процесса

18.

Праймеры
• температуры плавления двух праймеров не должны различаться более
чем на 5 °С;
• ГЦ-состав их должен уложиться в интервал 40–60%;
• в структуре олигонуклеотидов не должно быть шпилек (участков,
комплементарных друг другу);
• праймеры не должны образовывать дуплексы (спариваться) друг с другом.
• Еще лучше, если на 3ˊ-конце праймера будет гуанин или цитозин: они
образуют с комплементарными основаниями три водородные связи (между
А и Т образуются две), что делает комплекс праймер—матрица более
стабильным.
Tm(°C) = 2 х (A+T) + 4 х (G+C)

19.

20.

21.

Сравнение специфичности и эффективности амплификации геномной ДНК
человека с помощью Taq ДНК-полимеразы и HS Taq ДНК-полимеразы
В смесь добавляют
полимеразу в комплексе
с антителами,
блокирующими
ее активность.
На первой стадии ПЦР
(при 95 °С) антитела
денатурируют,
полимераза
освобождается и только
тогда начинает работу
А - фрагмент гена KIR длиной 1600 п.о.
Б - фрагмент LINE-последовательности длиной 240 п.о.
30 циклов ПЦР, 5 нг ДНК матрицы на старт. Дорожка М – маркер 1 kb DNA Ladder

22.

Программа для проведения ПЦР

23.

Типы ПЦР

24.

ПЦР в реальном времени - это семейство методик количественного PCR со
следующими чертами:
Определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации.
Построение по этим данным кинетической кривой PCR.
Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой
кривой.
Кинетические кривые real-time PCR
Для детекции PCR-продукта используются флуоресцентные красители,
обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта репортерную флуоресценцию.

25.

26.

Использование интеркалирующих агентов

27.

Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay)

28.

Мультиплексная ПЦР
Результаты мультиплексной ПЦР ДНК пациента с миодистрофией Дюшенна.
К дистрофии приводят различные мутации экзонов гена белка дистрофина.
На дорожке 7 нет полосы, соответствующей экзону 48 (длиной 506 п.н.) этого
гена.

29.

Мультиплекс на 9 растительных вирусов
температуры отжига праймеров не должны сильно разниться (то есть длина
каждого праймера должна быть 18–28 нуклеотидов, а ГЦ-состав — 45–60%);
каждый набор праймеров должен давать фрагмент, отличный от других
по размеру, чтобы после электрофореза в геле полосы не совпадали.

30.

Мультиплекс на 9 растительных вирусов

31.

Мультиплекс на 9 растительных вирусов
two-steps multiplex RT-PCR
one-step mRT-PCR

32.

Мультиплексная ПЦР в реальном времени

33.

Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченых зондов для
видоспецифичной экспресс-идентификации ортопоксвирусов на основе
мультиплексной ПЦР в реальном времени
Зонд Hex
Зонд Fam

34.

Цифровая ПЦР
Схема цифровой ПЦР с использованием системы QX200™ от Bio-Rad

35.

Цифровая ПЦР
• возможность осуществлять точный абсолютный количественный подсчет
целевого фрагмента ДНК в образце;
• чувствительность системы, которая позволяет детектировать единичные
молекулы ДНК-мишени даже при низкой её концентрации в образце;
• стабильность системы и её устойчивость к ингибиторам ПЦР

36.

«Гнездовая» ПЦР
Уменьшение вероятности амплификации неспецифических фрагментов
В одной пробирке
В два раунда
Гнездовая ПЦР используется для детекции ДНК в следовых количествах (1-100
копий на пробу).

37.

«Гнездовая» ПЦР

38.

ПЦР + капиллярный электрофорез

39.

Обратная транскрипция-ПЦР
Схема реакции обратной транскрипции

40.

Опосредованная образованием петель
изотермическая амплификация
LAMP (loop-mediated isothermal amplification)
Bst-полимераза из Bacillus stearothermophilus, совмещающая полимеразную и
хеликазную активности
исключается фаза денатурации, реакция проводится при 60–65 °С
используется четыре или шесть праймеров, что увеличивает специфичность реакции
НО
повышается вероятность артефактов и эффекта множественности полос
в электрофорезном геле

41.

LAMP: регистрация результата
Естественный свет
УФ свет
даже 5 молекул ДНК в 25 мкл детектируются этим методом

42.

Сравнение эффективности LAMP с добавлением петлевых праймеров
(пустые кружки) с классической LAMP (зачернённые кружки)

43.

Сравнение методов ПЦР и LAMP
Критерий
ПЦР
LAMP
Необходимость
плавления ДНК
+
−
Температура (°C)
94, 55–60, 72
60–65
Устойчивость
к биологическим
компонентам
−
+
Продолжительность
(минут)
90–120
5–20
Регистрация продукта
электрофорез
невооружённым глазом