Методы анализа, основанные на испускании излучения. Особенности валидации физико-химических методов

1. Лекция № 7

«Методы анализа, основанные на
испускании излучения. Особенности
валидации физико-химических
методов.»
1

2. Методы анализа лекарственных веществ, основанных на испускании излучения.

Фотометрия пламени
Флуоресцентные методы
Радиохимические методы
2

3. Эмиссионная фотометрия пламени

Метод эмиссионной
фотометрии пламени
основан
на измерении
интенсивности света, излучаемого возбуждёнными частицами (атомами или
молекулами) при введении вещества в пламя горелки.
Аналитические возможности метода - определение щелочных и
щелочноземельных металлов. Они ограничены возможностями источника
возбуждения - пламени. Оно обладает меньшей энергией возбуждения, чем
другие источники (дуга, искра и т.п.), поэтому в пламени возбуждаются
только элементы с низким потенциалом возбуждения.
Принцип метода заключается в следующем. Анализируемый раствор
распыляют в виде аэрозоля в пламя горелки. Возникающее излучение
определяемого
элемента
отделяется
от
постороннего
с
помощью
светофильтра и, попадая на фотоэлемент, вызывает фототок, который
измеряется с помощью микроамперметра.
3

4.

Метрологические характеристики метода:
экпрессность;
высокая селективность;
высокая точность (2-4%);
высокая чувствительность (10-6 %; Cmin,P - до 10-7 %).
4

5. Основные узлы приборов эмиссионной фотометрии пламени

Основными узлами приборов эмиссионной фотометрии пламени являются
атомизатор, монохроматизотор, детектор и индикатор.
Атомизатор - это источник высокой температуры. В нём одновременно
происходят атомизация пробы и возбуждение атомов. В качестве атомизатора
в приборах эмиссионной фотометрии пламени используется газовая горелка.
Монохроматизатор - это устройство для получения монохроматического
света. В нём значимый сигнал отделяется от мешающих сигналов. В качестве
монохроматизатора
в
приборах
эмиссионной
фотометрии
пламени
используются светофильтры.
Детектор - это устройство для приёма и регистрации аналитического
сигнала. В качестве детектора в приборах эмиссионной фотометрии пламени
используются фотоэлементы и фотоумножители.
Индикатор - это устройство для измерения аналитического сигнала.
Чаще всего в этой роли выступает микроамперметр.
5

6. Пламя, его характеристики

Пламя - это низкотемпературная равновесная плазма.
Основными характеристиками пламени являются его состав и рабочая
температура.
В состав пламени всегда входят два газа:
горючий газ - природный газ, метан, пропан, ацетилен и др.;
газ-окислитель - воздух, кислород, озон, фтор и др.
Рабочая температура пламени колеблется в интервале 1700-3000 °С. Она
зависит от состава горючей смеси, т.е. от природы обоих газов и их
количественного соотношения в смеси. Например, часто используется пламя,
имеющее
состав
природный
газ
-
воздух.
Оно
является
самым
низкотемпературным: его рабочая температура составляет 1700-1800 °С.
Температура пламени достаточна для атомизации большинства элементов,
но её не хватает для возбуждения многих из них. Поэтому метод эмиссионной
фотометрии пламени применяют только для наиболее легко возбудимых
элементов - щелочных и щелочноземельных металлов.
6

7. Процессы, протекающие в пламени

При введении вещества в пламя происходят сложные физико-химические
процессы. Почти все они равновесные и зависят от температуры, протекают
последовательно и параллельно.
Аналитический сигнал формируется за счёт следующих процессов,
которые протекают последовательно.
1. Испарение растворителя.
2. Испарение твёрдых частиц, в результате чего твёрдые частицы
вещества переходят в газообразное состояние.
3. Атомизация (диссоциация молекул на атомы) в результате чего образуется
атомный пар.
4. Возбуждение свободных атомов.
5. Эмиссия - возвращение атомов в основное состояние с выделением
квантов света.
7

8.

Помимо указанных процессов, которые приводят к формированию
аналитического сигнала, в пламени имеют место также нежелательные
побочные процессы:
6. Ионизация.
Ионизация усиливается при уменьшении концентрации и увеличении
температуры.
При совместном присутствии двух и более элементов равновесие
ионизации смещается в сторону свободных атомов.
В результате свободных атомов определяемого элемента Mi станет
больше, следовательно, интенсивность излучения тоже увеличится. Этот
эффект увеличения интенсивности излучения в присутствии посторонних
элементов называется эффектом матрицы.
7. Образование соединений. В результате химических реакций с
компонентами пламени могут образоваться трудно диссоциирующие
химические соединения:
оксиды (например, СаО);
моногидроксиды (например, СаОН+);
карбиды и т. д.
8. Самопоглощение (реабсорбция) света невозбуждёнными атомами.
8

9. Факторы, влияющие на аналитический сигнал (помехи) в эмиссионной фотометрии пламени

В методе эмиссионной фотометрии пламени на величину аналитического
сигнала влияет большое количество разнообразных факторов, в результате чего
возникают различные помехи.
Спектральные помехи обусловлены:
наложением постороннего излучения от других элементов пробы, фона;
недостаточной монохроматизацией излучения.
Физические помехи обусловлены:
эффективностью работы распылителя;
физическими свойствами раствора (поверхностное натяжение, вязкость,
плотность).
Для уменьшения физических помех в раствор вводят добавки ПАВ
(поверхностно-активных веществ) с целью уменьшения вязкости и
поверхностного натяжения.
Помехи, связанные с процессами в пламени, вызваны протеканием
нежелательных побочных процессов:
ионизация;
образование соединений с компонентами пламени:
9
самопоглощение.

10.

Пламенная фотометрия использована для количественного анализа Na-, Kи Ca- содержащих препаратов в лекарственных формах. На основе
исследования влияния на эмиссию определяемых катионов, органических
анионов, вспомогательных и сопутствующих компонентов были разработаны
методики количественного определения натрия гидрокарбоната, натрия
салицилата, ПАСК-натрия, билигноста, гексенала, натрия нуклеината,
кальция хлорида и глюконата, бепаска и др. Предложены методики
одновременного определения двух солей с разными катионами в
лекарственных формах, например калия иодида - натрия гидрокарбоната,
кальция хлорида - калия бромида, калия иодида - натрия салицилата и др.
Измерение интенсивности излучения спектральных линий испытуемых
элементов выполняют на отечественных пламенных фотометрах ПФЛ-1,
ПФМ, ПАЖ-1. Регистрирующими системами служат фотоэлементы,
связанные с цифровыми и печатающими устройствами. Точность
определений методами эмиссионной, как и атомно-абсорбционной,
пламенной спектрометрии находится в пределах 1-4%, предел обнаружения
может достигать 0,001 мкг/мл.
10

11. Флуоресцентные методы

Основаны на способности веществ флуоресцировать в УФ-свете. Эта
способность обусловлена структурой либо самих органических соединений,
либо продуктов их диссоциации, сольволиза и других превращений,
вызванных воздействием различных реактивов.
Флуоресцирующими
свойствами
обладают
обычно
органические
соединения с симметричной структурой молекул, в которых имеются
сопряженные связи, нитро-, нитрозо-, азо-, амидо-, карбоксильная или
карбонильная группы. Интенсивность флуоресценции зависит от химической
структуры и концентрации вещества, а также других факторов.
Флуориметрия может быть использована как для качественного, так и для
количественного
анализа.
Количественный
анализ
выполняют
на
спектрофлуориметрах. Принцип их работы состоит в том, что свет от ртутнокварцевой лампы через первичный светофильтр и конденсор падает на кювету
с раствором испытуемого вещества. Расчет концентрации проводят по шкале
стандартных образцов флуоресцирующего вещества известной концентрации.
11

12.

Разработаны
унифицированные
методики
количественного
спектрофлуориметрического
определения
производных
паминобензолсульфамида
(стрептоцид,
сульфацил-натрий,
сульгин,
уросульфан и др.) и п-аминобензойной кислоты (анестезин, новокаин,
новокаинамид).
Водно-щелочные
растворы
сульфаниламидов
имеют
наибольшую флуоресценцию при рН 6-8 и 10-12. Кроме того, сульфаниламиды,
содержащие в молекуле незамещенную первичную ароматическую аминогруппу,
после нагревания с о-фталевым альдегидом в присутствии серной кислоты
приобретают интенсивную флуоресценцию в области 320-540 нм. В той же
области флуоресцируют производные барбитуровой кислоты (барбитал,
барбитал-натрий, фенобарбитал, этаминал-натрий) в щелочной среде (рН
12-13) с максимумом флуоресценции при 400 нм. Предложены
высокочувствительные и специфичные методики спектрофлуориметрического
определения антибиотиков: тетрациклина, окситетрациклина гидрохлорида,
стрептомицина
сульфата,
пасомицина,
флоримицина
сульфата,
гризеофульвина и сердечного гликозида целанида. Проведены исследования
спектров флуоресценции ряда лекарственных средств, содержащих природные
соединения: производные кумарина, антрахинона, флавоноидов.
12

13. Рентгеновская флуоресценция

Перспективность
использования
рентгеновской
флуоресценции
для
определения малых количеств примесей в лекарственных препаратах
обусловливается высокой чувствительностью и возможностью выполнения
анализа
без
предварительного
разрушения
вещества.
Метод
рентгенофлуоресцентной спектрометрии оказался перспективным для
количественного анализа веществ, имеющих в молекуле такие гетероатомы,
как железо, кобальт, бром, серебро и др. Принцип метода заключается в
сравнении вторичного рентгеновского излучения элемента в анализируемом и
стандартном образце. Рентгенофлуоресцентная спектрометрия относится к
числу методов, не требующих предварительных деструктивных изменений.
Выполняют
анализ
на
отечественном
спектрометре
РС-5700.
Продолжительность анализа 15 мин.
13

14. Радиохимические методы

находят все более широкое применение в
фармацевтическом анализе. Радиометрический анализ, основанный на
измерении β- или γ-излучения с помощью спектрометров, использован
(наряду с другими параметрами) для оценки качества фармакопейных
радиоактивных препаратов. Широко применяют в различных областях
техники и, особенно в аналитической химии высокочувствительные методы
анализа с применением радиоактивных изотопов (меченых атомов). Для
обнаружения следов примесей в веществах используют активационный
анализ; для определения в смесях близких по свойствам трудно разделяемых
компонентов
-
метод
изотопного
разбавления.
Применяют
также
радиометрическое титрование и радиоактивные индикаторы. Оригинальным
вариантом сочетания радиоизотопного и хроматографического методов
является изучение диффузионно-осадочных хроматограмм в тонком слое
желатинового геля с помощью радиоактивных индикаторов.
14

15.

Фотометр
пламенный
автоматический
(133 635 руб.)
Флуориметр
мультиканальный
(167 727 руб.)
Спектрометр флюоресценции
рентгена Philips PW1606
15

16. Валидация аналитических методов исследования

В соответствии с современными требованиями производства
лекарственных средств, изложенными в российских документах
ГОСТ
Р
52249-04
и
СП
3.3
2.1288-03,
использование
валидированных аналитических методов является обязательным
требованием как при разработке новых лекарственных средств, так
и при их рутинном контроле.
Валидация
-
это
документированная
процедура,
дающая
высокую степень уверенности в том, что конкретный процесс,
метод или система будет приводить к результатам, отвечающим
заранее установленным критериям приемлемости.
16

17. Параметры валидации

Во всех нормативных документах по валидации аналитических методик
методологическая часть начинается с определения параметров валидации:
1. Правильность (accuracy)
—
близость
получаемых
результатов
к
истинному значению, оценивается по погрешности определения.
Смысл установления правильности результатов состоит в сравнении
данных с результатами правильного метода или в сопоставлении данных с
теоретически рассчитанными, результатами при использовании способов
доставки или смешивания проб.
Истинное значение для оценки правильности может быть получено
несколькими путями:
сравнить результаты метода с результатами валидилированного эталонного
метода (обычно редко применяется).
анализ
модельных
образцов
с
известными
концентрациями,
приготовленными полностью из стандартных веществ или методом добавок.
17

18.

2. Специфичность (specificity) - способность измерять точно и селективно
аналит (определяемое вещество) в присутствии компонентов, которые могут
ожидаться в матрице образца (примеси, родственные химические соединения,
продукты разложения), также оценивается по погрешности определения.
3. Точность (precision) - мера сходимости результатов при многократном
повторении аналитической процедуры. Точность метода обычно определяется
как степень согласованности результатов множественных анализов одного
образца.
Точность методики определяется несколькими параметрами:
сходимость,
воспроизводимость,
промежуточная сходимость.
18

19.

A. Сходимость (repeatability)- близость результатов индивидуальных тестов,
когда процедура анализа повторяется на многочисленных пробах гомогенного
образца одинаковых проб в нормальных условиях проведения анализа (иногда
переводится как повторяемость). Анализ должен быть выполнен в одной
лаборатории одним оператором на одном оборудовании за относительно
короткий промежуток времени.
B. Промежуточная точность - определяется сравнением результатов
выполнения метода в пределах одной лаборатории в течение нескольких
недель. Она отражает несоответствия в результатах, полученных различными
операторами, от различных приборов, с различными стандартами и
реактивами, с колонками различных партий или их комбинациями.
C. Воспроизводимость (reproducibility) - степень сходимости результатов,
полученных анализом одних и тех же образцов при различных нормальных
условиях теста (разные лаборатории, химики-аналитики, инструменты,
партии реактивов, температура окружающей среды, различное время
проведения анализов и т.п.). Цель состоит в том, чтобы проверить, обеспечит
ли метод те же самые результаты в различных лабораториях.
19

20.

Типичные переменные, влияющие на воспроизводимость метода:
различия в температуре и влажности окружающей среды;
различные опыт и аккуратность операторов;
различия в характеристиках оборудования и расходных материалов;
различные качество и срок годности реактивов и других материалов.
4. Линейность (linearity) - способность показать, что результаты теста (сразу
или после определенной математической обработки) пропорциональны
концентрации анализа в образце в пределах данного интервала.
5. Интервал метода (range) - оценивается проверкой того, как данный
аналитический метод обеспечивает точность, правильность и линейность при
определении образцов, содержащих аналит, на границах интервала и внутри
его.
6. Предел обнаружения (limit of detection) параметр предельных тестов минимальная концентрация аналита в образце, которая может быть
обнаружена, но не определена количественно в условиях анализа.
20

21.

7. Предел количественного определения (limit of quantification) - это
минимальная концентрация аналита в образце, которая может быть
определена с приемлемой точностью в условиях анализа.
8. Устойчивость
(robustness)
мера
-
способности
не
подвергаться
воздействию небольших, но запредельных отклонений параметров методики показывает точность и правильность в нормальных условиях.
9. Чувствительность
метода
-
способность
методики
испытания
регистрировать небольшие изменения концентрации.
Поскольку воспроизводимость и правильность чем выше, чем меньше их
количественные характеристики, Комитет Стандартов вводит еще и такие
понятия
как
невоспроизводимость,
воспроизводимости),
а
также
разброс
отклонение
от
(величина,
обратная
истинной
величины
(неправильность).
21

22. Этапы процесса валидации

1. Разработать протокол валидации или рабочий процесс для валидации, в
котором определить положение, цель и область метода, эксплуатационные
параметры и критерии приемки, валидационные эксперименты.
2. Определить
необходимые
рабочие
характеристики
оборудования,
квалифицировать материалы, например, стандарты и реактивы.
3. Исполнить эксперименты предвалидации, корректировать параметры
метода или критерии приемки в случае необходимости.
4. Исполнить полные внутренние и внешние эксперименты валидации.
5. Разработать СОП (стандартную операционную процедуру) для рутинного
выполнения метода, определить критерии для ревалидации.
6. Определить тип и частоту испытаний пригодности метода.
7. Документировать эксперименты и результаты валидации в отчете.
22

23. Последовательность проведения валидации

1. Постановка
минимума
требований
для
приемки
метода
(область
применения методики, разработка плана валидации с пошаговым
планированием валидационных экспериментов).
2. Определение специфичности (селективности) метода.
3. Исследование линейности.
4. Установление правильности метода.
5. Определение диапазона метода.
6. Изучение воспроизводимости.
7. Установление
предела
обнаружения
и
предела
количественного
определения.
8. Изучение стабильности методики.
9. Изучение устойчивости метода.
23

24. В отчёт о валидации методики необходимо включать:

1. цель и контекст метода (область применения, процедура);
2. тип анализируемых веществ и матрицы;
3. детальную информацию о реактивах, эталонах
и приготовлении
контрольных (стандартных) образцов;
4. процедуры для проверок качества стандартов и используемых реактивов;
5. соображения безопасности;
6. параметры метода;
7. критические параметры, установленные при испытании прочности;
8. перечень оборудования и его функциональных и эксплуатационных
характеристик;
9. детальные условия проведения экспериментов, включая подготовку
пробы: процедуры вычислений и статистической обработки результатов;
24

25.

10. процедуры для контроля качества в процессе эксплуатации методики
(например, испытания пригодности системы);
11. графическую
информацию,
например
хроматограммы,
спектры
и
калибровочные кривые;
12. пределы эксплуатационных данных для принятия метода;
13. ожидаемую неопределенность результатов измерения;
14. критерии для ревалидации;
15. специалистов, которые разрабатывали и первоначально валидировали
метод;
16. резюме и заключения.
25