Метаболизм ДНК

1. Метаболизм ДНК

2. Метаболизм ДНК

• Репликация – процесс точного копирования
молекулы ДНК.
• Репарация – поддержание целостности
биологического материала в ДНК.
• Рекомбинация –перестройка заключенной в
молекуле ДНК генетической информации.

3. Репликация

• Процесс самовоспроизведения
макромолекул нуклеиновых кислот,
обеспечивающий точное копирование
генетического материала и передачу его от
поколения к поколению.
• В основе репликации лежит понятие
матрицы – это макромолекулярная
структура для синтеза комплементарной
копии макромолекулы.

4.

• Репликация ДНК происходит в
определенной фазе клеточного цикла.
• Основные свойства процесса репликации
ДНК и каталитические механизмы этого
процесса практически идентичны у всех
видов организмов.

5. Основные принципы репликации ДНК

• Полуконсервативный механизм
- каждая из 2 цепей ДНК служит
матрицей для образования новой
цепи. Образуются две новые
двухцепочечные молекулы ДНК,
каждая из которых состоит из
одной новой и одной старой цепей.

6.

7.

• Субстратами для синтеза ДНК
являются
дезоксирибонуклеозидтрифосфаты
– dАТФ, dГТФ, dТТФ, dЦТФ,
выполняющие роль строительного
материала и источников энергии.

8.

• Точка начала репликации – origin
(ориджин).
• У бактерий в кольцевом геноме имеется
только одна точка «origin», тогда как у
эукариотических хромосом их множество.
• У человека репликация начинается в
точках, удаленных друг от друга от 30 до
300тыс.п.н.

9.

10.

• Репликон – это участок ДНК между
двумя «ориджинами» репликации.

11.

Родительская ДНК
Репликационный глазок
Дочерние молекулы ДНК
Репликативные вилки

12. Репликация идет в двух направлениях

13.

• Синтез новых цепей ДНК может
протекать только в направлении
5’ 3’, так как достраивается 3’конец цепи ДНК.

14.

5’
3’
3’
5’

15. Синтез ДНК

16.

• Вся сложность ферментативного аппарата
репликации связана с требованиями
высокой точности синтеза.
• Весь этот комплекс называется ДНКрепликативной системой, или
• Реплисомой.

17. Ферменты репликации

• Синтез новой цепи ДНК
осуществляется при помощи ДНКполимеразы.
• Фермент катализирует синтез
дочерних цепей на матрице ДНК по
принципу комплементарности.

18. Синтез ДНК

• У прокариот найдено 3 типа этих
ферментов:
• ДНК-полимераза I
• ДНК-полимераза II
• ДНК-полимераза III

19.

• ДНК-полимераза I выполняет функции
проверки поддержания порядка во время
репликации, репарации и рекомбинации.
• Обладает 5’ 3’ экзонуклеазной
активностью, может заменить участок ДНК
(или РНК), что используется в методах по
гибридизации нуклеиновых кислот.

20.

• ДНК-полимераза II – участвует в
процессах репарации ДНК при
повреждении ДНК ультрафиолетовым
облучением.

21.

• ДНК-полимераза III – главный фермент
репликации у E.coli.
• Состоит из субъединиц 10 разных типов.
• Обладает полимеразной активностью
(присоединяет 250-1000 нуклеотидов/с).
• Корректирующей активностью, т.е. 3’
5’ экзонуклеазной активностью, благодаря
которой каждый нуклеотид после присоединения
проверяется дважды.

22.

• Для создания Матрицы – одноцепочечной
ДНК, необходимы хеликазы –
ферменты, разделяющие цепи
двухцепочечной ДНК на одинарные цепи.

23.

• Хеликазы – это ферменты, способные
расплетать две комплементарные нити в
ДНК с использованием энергии,
полученной при гидролизе АТФ.

24.

• Топоизомеразы – ферменты,
изменяющие степень
сверхспирализации ДНК, путем
внесения одноцепочечных
или двухцепочечных разрывов в ДНК.

25.

• Топоизомеразы находятся перед
репликативной вилкой, разрезают молекулу
ДНК для облегчения ее расплетания и
раскручивания молекулы ДНК, после чего
непрерывность ее восстанавливается.

26.

• Антибиотики – ингибиторы топоизомеразы:
• Хинолоны, фторхинолоны
• Норфлоксацин

27.

• белки, стабилизирующие
разделенные нити ДНК – SSB
(single strand binding)

28.

• Роль SSB -белков заключается в том, что они
связываются с однонитчатой ДНК, выпрямляют
ее и блокируют образование шпилечных
двухнитчатых структур.
• Участие SSB в репликации абсолютно
необходимо. Они удерживают матричные цепи
ДНК в репликативной вилке в одноцепочечном
состоянии, а также защищают одноцепочечную
ДНК от действия нуклеаз.

29.

• ДНК-лигаза – фермент катализирующий
сшивание одноцепочечных фрагментов
ДНК.
• ДНК-праймаза — это фермент РНКполимераза, синтезирующий короткий
фрагмент РНК, называемый праймером,
комплементарный одноцепочечной матрице
ДНК.

30. Синтез ДНК

Синтез ДНК включает в себя
три этапа:
• инициация
• элонгация
• терминация

31. Инициация

• инициация синтеза ДНК у E.coli
происходит в oriC (245п.н.)
• В точках начала репликации отмечено
большое количество А=Т пар и
участки связывания ключевого
инициаторного белка DnaA.

32.

• Процесс инициации начинается с
присоединения к хромосоме белка DnaA
(в origin области).
• 8 молекул DnaA, каждая из которых
связана с АТФ, образуют спиральный
комплекс (положительная
суперспираль). В соседних участках
ДНК это вызывает денатурацию А=Т
богатого участка.

33.

DnaА
белки
Dna A белки садятся на oriC
– участок начала
репликации
Индуцируется
расплетение ДНК
Расплетенный участок индуцирует
прикрепление SSB-белков и хеликаз (Dna B)
Хеликазы
SSB - белки

34.

• Это приводит к разделению цепей и
способствует работе основного
расплетающего белка - хеликазы (DnaB).
• С образовавшейся одноцепочечной ДНК
связываются белки SSB, которые
стабилизируют вилку репликации.

35.

Хеликазы
Хеликазы разделяют ДНК в двух направлениях
в районе двух вилок
вилка
вилка

36.

37. Синтез ДНК

• В результате действия хеликазы,
топоизомеразы, SSB- белков,
ионов Mg+2 образуется
репликативная вилка - участок
ДНК, в пределах которого спираль
раскручена и разделена на
отдельные цепи.

38. Синтез ДНК

• ДНК-полимераза III не способна
начинать синтез новой цепи с ее
первого нуклеотида. Поэтому
репликация начинается с синтеза
праймера (РНК-затравки) на
обеих цепях расплетенной ДНК.

39. Синтез ДНК

• Праймер - короткий сегмент РНК,
комплементарный матричной цепи
ДНК.
• Праймер синтезируется при
участии ДНК- зависимой РНКполимеразы (праймазы).

40. Синтез ДНК

• от 3’ –конца праймера начинается
синтез новой цепи ДНК при
помощи ДНК- полимераза III.
Синтез идет в направлении 5’ 3’

41. Синтез ДНК

• ДНК-полимераза III удлиняет
РНК-затравку, присоединяя к ней
один за другим нуклеотиды,
комплементарные матричной цепи

42. Элонгация

• Синтез лидирующей цепи.
• Синтез отстающей цепи.

43.

• Синтез лидирующей цепи начинается с
синтеза праймера, дезоксирибонуклеотиды
добавляются к этому праймеру ДНКполимеразой III, связанной с DnaВхеликазой.
• Синтез идет непрерывно со скоростью,
соответствующей скорости раскручивания
ДНК в репликативной вилке.

44. Синтез отстающей цепи

• Синтез осуществляется в виде коротких
фрагментов ОКАЗАКИ.
• Каждый фрагмент Оказаки состоит
примерно из 1000 нуклеотидов
(у прокариот).
• Праймаза синтезирует РНК-праймер.

45.

• ДНК-полимераза III связывается с
праймером и присоединяет
дезоксирибонуклеотиды.
• Синтез фрагментов Оказаки происходит с
участием ферментативного аппарата –
праймасомы ( DnaB-хеликаза и DnaGпраймаза) в составе репликативного
комплекса.

46.

• Реплисома присоединяет по 1000
нуклеотидов в секунду к каждой цепи
(лидирующей и отстающей).
• После завершения сборки одного
фрагмента Оказаки его РНК-праймер
удаляется и замещается
последовательностью ДНК с помощью
ДНК-полимеразы I.

47.

• Оставшийся разрыв «сшивает» ДНК-лигаза.
• ДНК-лигаза катализирует образование
фосфодиэфирной связи между 3’гидроксильной группой на конце одной
цепи ДНК и 5’-фосфатом на конце другой
цепи.
• Для этой реакции используется НАДкофактор в качестве источника АМФ (у
прокариот).

48.

49. Терминация

• У прокариот есть специальные
терминаторы (ter) – специальные
последовательности нуклеотидов,
прекращающие синтез цепи ДНК
• Ter-последовательности служат
участками связывания белка Tus
(terminus utilization substance)

50.

• Комплекс Ter-Tus может задержать
репликативную вилку, движущуюся только
в одном направлении, т.е. останавливает
одну из вилок с которой сталкивается.
Другая вилка останавливается, когда
встречается с первой задержанной вилкой.

51.

• Для терминации репликации линейных
эукариотических хромосом на концах
каждой хромосомы синтезируются
специальные структуры, называемые
теломерами.
• Иначе с каждым клеточным делением
хромосомы становились бы короче и
короче.

52.

• Это многократно повторяющиеся
последовательности нуклеотидов ( у
одноклеточных эукариот от 20 до100, у
млекопитающих превышает 1500).
• У человека такая последовательность
(TTAGGG)n .

53.

• Теломеры присоединяются к концам
эукариотических хромосом с помощью
фермента теломеразы.

54.

• Одна из причин старения — закон делимости клеток,
открытый американским биологом Леонардом
Хейфликом (Leonard Hayflick) в 1961 году. Суть его в
том, что клетки человеческого организма не могут
делиться бесконечно. Максимально возможное
количество делений в среднем составляет 50±10 (так
называемый предел или лимит Хейфлика).
• Вызвано это тем, что при делении клетки репликация ДНК
происходит "с потерями" — молекула копируется не до
конца. До определенного момента в этом ничего
страшного нет — кончики хромосом защищены
теломерами, которые и теряются при копировании..

55.

• есть клетки, которые могут делиться
бесконечно, например кроветворные или
раковые. В этих случаях механизм
ограничения количества делений не
срабатывает благодаря теломеразе, которая
"чинит" ДНК, достраивая теломеры.

56. Источники повреждения ДНК

УФ излучение
Радиация
Химические вещества
Ошибки репликации ДНК
Апуринизация - отщепление азотистых
оснований от сахарофосфатного остова
• Дезаминирование - отщепление аминогруппы от
азотистого основания

57. Репарация ДНК

• Репарация- процесс восстановления
повреждений ДНК.
• Распознавание дефекта
сопровождается непосредственно при
репликации, все ДНК-полимеразы
обладают 3’ 5’ экзонуклеазной
активностью.

58.

• Репарация осуществляется с помощью:
специфического набора ферментов, постоянно
присутствующих в нормально функционирующих
клетках (фотореактивационная, эксцизионная)
• активации группы генов, контролирующих
различные клеточные функции –
SOS-репарация.

59.

• У бактерий имеются 2 ферментные
системы, ведущие репарацию:
прямая
эксцизионная

60. Прямая репарация ДНК

• Фотореактивация. Расщепление
пиримидиновых димеров (приУФ
облучении) осуществляется
ферментом
ДНК - фотолиазой.
Реакция расщепления связей зависит от
видимого света. У человека отсутствует.

61.

фермент ДНК – фотолиаза - мономерный флавинзависимый фермент и 2 кофактора (хромофоры).
• 5,10-метенилтетрагидрофолат (5,10-MTГФ) –
поглощает фотоны синего цвета (300-500 нм) и
передает энергию возбуждения на FADH- .
• Возбужденный FADH- отдает электрон
пиримидиновому димеру, устраняя повреждение.

62. Репарация ДНК

63. Репарация ДНК

• Темновая эксцизионная
репарация
• Не нуждается в энергии видимого
света

64.

Каждая из систем репарации включает следующие
компоненты:
• фермент, «узнающий» химически изменённые участки в
цепи ДНК и осуществляющий разрыв цепи вблизи от
повреждения.
• фермент, удаляющий повреждённый участок.
• фермент, синтезирующий соответствующий участок цепи
ДНК взамен удалённого.
• фермент, замыкающий последнюю связь в полимерной
цепи и тем самым восстанавливающий её непрерывность.

65. Эксцизионная репарация

• Base excision repair – BER
• ДНК гликозилазы, распознают аномальные
основания ДНК и катализируют гидролитическое
расщепление N-glycosyl связи, между основанием
и сахаром.
• Образуется AP-сайт (apurinic/apyrimidinic).
• АП-сайт распознается АП-эндонуклеазой,
которая вводит в нить ДНК разрыв.

66.

• Фосфодиэстераза отщепляет от ДНК
сахарофосфатную группу, к которой не
присоединено основание.
• Брешь размеров в 1 н. застраивается
ДНК-полимеразой I и концы ДНК
соединяются ДНК-лигазой.

67.

• Nucleotide excision repair - NER
• Узнавание повреждений.
• Связывание мультисубъединичного комплекса с
поврежденным сайтом.
• Двойное надрезание поврежденной цепи на
несколько нуклеотидов.
от поврежденного сайта в обоих направлениях
5' и 3'.

68.

• Освобождение олигонуклеотида,
содержащего повреждение между двумя
надрезами.
• Заполнение образовавшейся бреши ДНК
полимеразой.
• Лигирование.

69.

• При некоторых типах повреждений ДНК
(двухнитевые разрывы,поперечные
сшивки).
• Репликативная вилка наталкивается на
нерепарированное повреждение ДНК.
• Результат воздействия ионизирующей
радиации.
• Окислительные реакции.

70. SOS-репарация

• SOS – белки всегда присутствуют в клетке, но
при запуске SOS-ответа их уровень значительно
повышается.
• Мутации, возникающие в результате такой
репликации, приводят к гибели одних клеток и
опасны для других, но репликация не
прекращается, позволяет выжить некоторым
мутантным дочерним клеткам.

71.

• В геноме типичной клетки млекопитающих
за 24 ч аккумулируется много тысяч
повреждений. Благодаря репарации менее
одного повреждения из 1000 становится
мутацией. Изменения в генах репарации
значительно повышают чувствительность к
раку.

72.

• Все дефекты генов белков, участвующих в
эксцизионной репарации связаны с
онкологическими заболеваниями,
• генетическими заболеваниями, например,
пигментная ксеродерма.

73.

• У человека нет ДНК-фотолиазы и
эксцизионная репарация оснований –
единственный способ репарации
пиримидиновых димеров.
• Инактивация этой системы связана с
развитием рака кожи, который
индуцируется солнечным светом.

74. Молекулярные мутации

• Анемия Фанкони – генетические
отклонения, возникающие при репарации
ДНК.
• Болезнь названа в честь швейцарского
педиатра, Гвидо Фанкони, впервые
описавшего это заболевание.

75.

• У 60—75 % больных также встречаются врожденные дефекты, такие
как низкорослость, ненормальная пигментация, маленькая голова,
аномалии скелета
• Ряд неврологических расстройств (косоглазие, недоразвитие одного
или обоих глаз, опущение века, глазное дрожание, глухота,
умственная отсталость),
• Поражения половых органов (недоразвитие половых органов)
• Почечные аномалии
• Врождённые пороки сердца.
• Средняя продолжительность жизни у больных анемией Фанкони
составляет около 30 лет.