Криоконсервация эмбрионов

1. Лекция 6. Криоконсервация эмбрионов

Содержание:
1. Основные определения………………………….
2. История развития криобиологии……………….
3. Механизмы действия низких температур
на живые объекты……………………………..
4. Технология криоконсервации эмбрионов……..

2. 1 Основные определения

3.

Криоконсервация – (греч. кryos – холод, мороз)
глубокое замораживания биологических объектов в
жидком азоте с целью временной остановки
метаболизма в обратимой степени.
Анабиоз (греч. anabíōsis — оживление, от ana- —
вновь и bíos — жизнь), состояние организма, при
котором жизненные процессы (обмен веществ и др.)
временно прекращаются или настолько замедлены, что
отсутствуют все видимые проявления жизни.
Синонимы: биостаз, криостаз, абиоз, криптобиоз

4.

Криобиология
– раздел биологии, изучающий
действие на живые системы низких и сверх низких
температур (от 0 до -2730С)
выяснение нижних температурных границ жизни
разработка методов хранения биологических
объектов
выведение морозоустойчивых сортов
лечение с помощью холода - криотерапия
деятельность человека в полярых условиях и в
космосе

5. История развития криобиологии

2
История развития
криобиологии

6.

Античные времена….
Древнеримский историк Афиней Навкразийский
впервые описал явление вмерзания в лед рыб и
земноводных зимой.

7.

XVII век: первые эксперименты по заморажианию
живых объектов
Генри Пауэр – эксперименты по замораживанию
угриц (круглых чрвей)

8.

1701 г. - Антони ван Левенгук –
открытие мнимой смерти, «вита
минима» у простейших. «…жизнь при
замораживании приостанавливается.
Организм как бы не жив не мертв»
коловратка

9.

Ладзаро Спалланцани
(1729 – 1799)
итальянский ученый-натуралист,
аббат
1777 г.– опыты с коловратками, замораживание земноводных
и пресмыкающихся.
«… замораживание, высушивание – полное прекращение
жизни, а затем воскрешение»
Tardigrada - тихоходка

10.

Что есть анабиоз?
Смерть
Приостановка жизни
Воскресение
Восстановление жизни
Папа Римский

11.

XIX в. – создание криогенных установок
1852 г. - Карл Линде (1842— 1934) - получение
сжиженного воздуха
1866 г. - Рауль Пиктэ – получение жидкого кислорода,
замораживание лягушек до – 280 С, простейших – до 600 С.
1898 г. - Джеймс Дьюар (1842— 1923) получение
сжиженного
водорода,
изобретение сосуда для хранения
сжиженных газов
1873 г. - немецкий ученый Вильгельм Прайер
предложил термин «анабиоз»

12.

Бахметьев
Порфирий Иванович
(1860 – 1913)
русский биофизик, один из
основоположников
криобиологии
обосновал возможность выхода из
замораживания живых объектов, если
тканевые жидкости остаются в
переохлажденном, но жидком состоянии
вызвал анабиоз у млекопитающих
(летучих мышей)

13.

Эксперимент Бахметьева П.И. с термоэлектрическим
методом измерения температуры
Термоэлектрический
термометр
При кристаллизации переохлажденной жидкости
Т,
выделялась теплота, приводящая к повышению
+
температуры тела.
20Размораживание вскоре после начала температурного
скачка приводило к оживанию.
0С
10
0
Температурный
скачок
Холодная камера
-10
Время, мин

14.

1922 - В. В. Ефимов - причина гибели при замораживании образование кристалликов льда в цитоплазме клетки
1938 г. - Б. Лайет, А. и С Гетц - при быстром охлаждении
(сотни градусов в секунду) вода превращается я в аморфную
массу, не повреждая клетки
1955 г. - Л. К. Лозина-Лозинский - открытие морозоустойчивости
у насекомых
1958 г. - Луи Рей - замораживание сердца зародыша цыпленка,
помещенное в глицерин до —196°С с дальнейшим
восстановлением сокращений

15.

1960-е гг. - Роберт Эттинджер
(США) - возникновение
крионики
Крионика - это область научно-практической деятельности,
которая интегрирует в себя криобиологию, криогенную
инженерию и практику клинической медицины с целью
разработки и применения криостаза.
Криостаз - консервация обреченных на смерть пациентов
путем их замораживания до ультранизких температур, с
целью их переноса в будущее, когда будет доступна
технология для репарации клеток и тканей и будет возможно
восстановление всех функций организма и здоровья в целом.

16.

17.

Из лекции П.И. Бахметьева (Киев, 1913 г.): «Мечников занят
сейчас опытами по возрождению человека, пытаясь вернуть ему
вечную молодость, превратить старика в юношу. Я не сомневаюсь
в том, что когда-нибудь, через десять, двадцать пять, сто лет, этого
добьются. Но когда? …..Может быть, тогда, когда никого из нас,
присутствующих здесь, не будет среди живых... Но и нам хочется
испытать такое счастье. И вот мы прибегаем к помощи анабиоза...
Потом придет смерть, будет искать нас и спрашивать: где же они?
И окажется, что «нас» нет, что мы укрылись от смерти каким-то
таинственным способом. И смерть, опозоренная, уйдет. А в это
время я буду спокойно спать в анабиотическом состоянии...
Промчатся годы. Появится какой-нибудь «Мечников второй» или
«Мечников третий» и откроет «секрет вечной молодости». И тогда
меня разморозят, и я оживу... мое старческое сердце станет снова
молодым,
двадцатилетним...»

18.

Научный
иммортализм
(бессмертие) –
это
философское направление, которое включает в себя:
• естественнонаучное
обоснование
возможности
радикального продления жизни человека вплоть до
достижения им физического бессмертия;
• поиск
оптимальных
социально-экономических
моделей устройства общества, состоящего из
бессмертных индивидуумов;
• мировоззрение людей, которые хотят быть
физически бессмертными, считают, что это
достижимо научными средствами и что бессмертие
является благом для человечества.

19.

Трансгумани́зм философское движение, в основе
которого лежит предположение, что человек не
является последним звеном эволюции, а значит, может
совершенствоваться до бесконечности.
Последователи движения утверждают, что можно и
нужно ликвидировать старение и смерть; значительно
повысить умственные и физические возможности
человека; изучать достижения, перспективы и
потенциальные опасности использования науки,
технологий,
творчества
и
других
способов
преодоления фундаментальных пределов человеческих
возможностей.

20. Механизмы действия низких температур на живые объекты

3
Механизмы действия низких
температур на живые объекты

21.

1. Переход жидкой фазы в твердую
• при замерзании растворов солей вода,
превращаясь в лед, уходит из раствора, при этом
концентрация вещества в оставшейся жидкой фазе
повышается до концентрации насыщенного
раствора.
Насыщенный
раствор
насыщенного
• температура кристаллизации
раствора называется эвтектической (точкой
эвтектики)
• биологические жидкости – сложные растворы
-110C
минеральных и KCl…..
органических
веществ (солей,
0C
белков, липидовNa
и др.)
с эвтектической
Cl….-21,8
0С
0C
температурой -30…-80
Эвтектическая
CaCl2…-54,9
температура

22.

Структура твердой фазы – зависит от скорости
охлаждения
Кристаллическая
Дендритные кристаллы – разветвленной
гексагональной формы, образуются при
медленном охлаждении, приводят к разрушению
клеток.
Сферулитные кристаллы – мелкие, округлой
формы, образуются при быстром охлаждении, не
разрушают клетки.
Аморфная, стеклообразная – образуется при
витрификации – сверхбыстром охлаждении
жидкости, не повреждает клетки

23.

Кристаллы-дендриты

24.

Рекристаллизация – переход кристаллов из неповреждающей
формы (сферулиты) в повреждающую (дендриты) при
медленном размораживании.
Т,
0С
Быстрое
размораживание
Медленное
размораживание
сферулиты
дендриты
Время, мин

25.

Разрушающее действие кристаллизации

26.

2. Дегидратация (обезвоживание) – выход воды из
клеток при замораживании.
Лёд
Уход свободной воды в твердую фазу приводит к
повышению
концентрации солей в межклеточном
Гиперконцентрированный
пространстве.
раствор Возникает осмотическое давление,
направленное из клеток.
Выход воды из
клеток

27.

Влияние дегидратации на клетки
свободной
- до Удаление
50% связанной
водыводы,
можетуменьшение
быть удалено из
кристаллообразования
– при медленном охлаждении
клеток
без нарушения их жизнеспособности
происходит более полная дегидратация
Нарушение внутреннего гомеостаза клетки
Температурный
шок
ослабление тургора клеток
изменение рН, инактивация белков,
нарушение проницаемости мембран
выход гидролитических ферментов из
лизосом

28.

Криоповреждающие факторы:
Т, 0С
20
10
1. Дегидратация
2. Механическое воздействие
кристаллов льда
0
-10
Время, ч.
-196

29.

Приспособление животных к низким температурам

30.

Гусеницы боярышницы зимуют
в листьях черемухи на открытом
воздухе при – 30…500С

31.

Криопротекторы – вещества, предохраняющие
биологические объекты от криоповрежедений.
Проникающие в клетку, эндоцеллюлярные, М<400:
глицерин, диметилсульфоксид (ДМСО), гексоэтиловый
крахмал -
Непроникающие в клетку, экзоцеллюлярные,
М>400: сахароза, поливинипирролидон (ПВП) –
формируют вокруг клеточных мембран защитную
оболочку

32.

Глицерин (глицерол): С3О3Н8
Н 2С
ОН
НС
ОН
Н 2С
ОН
Свойства:
Молекулярная масса
92.09 г/моль
Плотность
1.261 g/cm3
Температура плавления
18 °C
Температура кипения
290 °C
Пищевая энергетическая ценность 4.32 ккал/

33.

Криозащитные свойства глицерина:
уменьшает количество свободной воды в клетках,
образуя с молекулами воды водородные связи;
понижает эвтектическую температуру жидкости;
растворяет многие соли, снижая вредное действие их
гиперконцентрации;
способствует образованию мелкокристаллической
структуры твердой фазы и витрификации;
образует защитную оболочку вокруг молекул белков,
предотвращает денатурацию;
при охлаждении уменьшается в объеме, компенсируя
давление расширяющегося льда.

34. Технология криоконсервации эмбрионов

4
Технология
криоконсервации
эмбрионов

35.

Для криоконсервации пригодны эмбрионы,
оцененные по морфологической шкале оценки
качества на 4 и 5 баллов
Основные этапы технологии криоконсервации:
1. Насыщение эмбрионов криопротектором
2. Сборка контейнера
3. Замораживание
4. Хранение
5. Размораживание

36.

1. Насыщение эмбрионов криопротектором
Питательная среда
- происходит путем последовательного
перемещения эмбриона (на 5 мин.) в растворы
криопротектора с увеличивающейся
концентрацией.
0,25 М раствор
глицерина
0, 50 М раствор
глицерина
Питательная среда с
криопротектором
0,75 М раствор
глицерина
1,0 М раствор
глицерина

37.

2. Сборка контейнера (пайетты), маркировка
Воздух
Пробка-фильтр
Воздух
Среда
Среда
Среда с эмбрионом
Бла 1, Лаура 2349 15.02.2008.

38.

39.

3. Замораживание – проходит в несколько этапов:
охлаждение от +20 до - 5..70 С (10 С в мин.);
вызывание кристаллизации среды - для ускорения
дегидратации эмбриона (вызывается переохлажденным
пинцетом);
медленное охлаждение от - 7 до -350 С (0,30 С в мин.)
– происходит удаление из клеток не связавшейся воды;
быстрое охлаждение от -35 до -1960 С (мгновенно) –
витрификация внутриклеточной жидкой фазы.

40.

Температурный график замораживания
Т, 0С
Охлаждение внешней среды
30
Кристаллизация внешней среды
20
10
0
-10
-20
-30
-40
Дегидратация
Витрификация
внутренней среды
эмбриона
-50
-100
Время, ч.
-200
0
1
2

41.

Замораживание проводится в специальных приборах
– автоматических замораживателях
Корпус
замораживателя
Пайетты в гнездах
Нагревательная
спираль
Программное
устройство
Жидкий азот
Замораживающая
камера

42.

4. Хранение эмбрионов – осуществляется в сосудах
Дьюара.
Контейнер
Сосуд Дьюара
АЗОТ
Канистра
- 1960 С

43.

44.

5. Размораживание:
оттаивание – проводится быстро, чтобы избежать
рекристаллизации
30 - 320 С
АЗОТ

45.

отмывка эмбриона от криопротектора
Среда с криопротектором
1,0 М раствор
глицерина
После размораживания эмбрионы оценивают
по0,75
шкале
морфологической оценки качества.
М раствор
глицерина
0, 50 М раствор
глицерина
0,25 М раствор
глицерина
Питательная среда

46.

Практическое значение криоконсервации
эмбрионов:
возможность длительного сохранения ценного
генетического материала;
сокращение потребности в реципиентах;
транспортировка на дальние расстояния, экспорт,
импорт эмбрионов;
сохранение генофонда редких и исчезающих пород и
видов животных в криобанках.

47.

Конец