Методы выделения и анализа биопрепаратов. Биологические макромолекулы, особенности структурно-функциональной организации

1.

Биофизическая химия
Тема 1
Методы выделения, очистки и анализа
биопрепаратов
Биологические макромолекулы, особенности
структурно-функциональной организации

2.

Методы выделения, очистки и анализа биопрепаратов
Методы разделяются на препаративные и аналитические.
Препаративные методы применяют для получения больших объемов активных
препаратов биологических соединений, которые далее используются в научных
и практических целях.
Аналитические методы используют малые объемы биопрепаратов для анализа
чистоты, свойств, активности биологических соединений. Часто в процессе
анализа биопрепарат необратимо разрушается.

3.

Методы выделения, очистки и анализа биопрепаратов
Общая схема выделения и анализа биопрепаратов

4.

Методы выделения, очистки и анализа биопрепаратов
Методы
препаративного
биомолекул
хроматография
ультрацентрифугирование
электрофорез
фракционирования

5.

Методы выделения, очистки и анализа биопрепаратов
Методы анализа структуры и свойств биомолекул
дифракция рентгеновских
лучей
(рентгеноструктурный
анализ)
прямая информация о пространственной структуре
(расположении всех атомов в пространстве).
Необходимы гомогенные, хорошо очищенные,
кристаллические препараты вещества
Непрямые методы исследования структуры и свойств
(позволяют изучать биомолекулы в растворе в условиях, когда их состояние и
поведение приближено к нативному состоянию молекул в клетке)
электронная микроскопия
форма и размер макромолекул, упаковка
субъединиц, расположение субъединиц в
ассоциатах
электрофорез,
седиментационный
анализ,
хроматография
чистота препарата, субъединичный состав,
форма и размер макромолекул,
молекулярная масса

6.

Методы выделения, очистки и анализа биопрепаратов
Методы анализа структуры и свойств биомолекул
Абсорбционная
спектроскопия
(спектрофотометрия)
вторичная структура макромолекул,
ионизация отдельных групп,
контроль технологических процесов
Дифференциальная
спектрофотометрия
конформационные изменения макромолекул
Инфракрасная
спектроскопия
(ИК-спектроскопия)
вторичная структура и колебания макромолекул
Круговой дихроизм
(КД-спектроскопия)
вторичная структура, связывание с лигандами
Спектроскопия
комбинационного
рассеяния
конформационные изменения макромолекул

7.

Методы выделения, очистки и анализа биопрепаратов
Методы анализа структуры и свойств биомолекул
Флуоресцентная
спектроскопия
(флуоресценция)
конформационные изменения макромолекул,
подвижность групп и динамика структуры
ЯМР
(ядерный магнитный
резонанс)
конформация макромолекул, изменения структуры
ЭПР
(электронный
парамагнитный
резонанс)
конформация макромолекул, подвижность групп

8.

Методы выделения, очистки и анализа биопрепаратов
Методы детекции и идентификации биомолекул
Гибридизация
нуклеиновых кислот
анализ препаратов ДНК и РНК
ПЦР
(полимеразная цепная
реакция)
анализ препаратов ДНК и РНК
Масс-спектрометрия
анализ препаратов химических соединений
Иммунохимические
методы анализа
детекция клеток, фрагментов клеток, белков,
комплексов биомолекул
Биосенсоры,
биочипы
детекция и идентификация молекул

9.

Биологические макромолекулы, особенности
структурно-функциональной организации
В клетках синтезируются 3 типа
(биополимеров):
белки,
нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК),
полисахариды.
биологических
макромолекул
Макромолекулы полисахаридов состоят из одинаковых звеньев и,
поэтому, не несут информации. Они выполняют либо опорную
функцию (целлюлоза в растениях), либо запасающую функцию
(крахмал в растениях, гликоген у животных).
гликоген

10.

Биологические макромолекулы, особенности
структурно-функциональной организации
Белки и нуклеиновые кислоты являются информационными
молекулами, кодирование информации в которых осуществляется
последовательностью различных звеньев (аминокислот в составе
белков, нуклеотидов в составе ДНК и РНК), определяющей
пространственную структуру макромолекулы и ее функцию.
первичная структура ДНК

11.

Биологические макромолекулы, особенности
структурно-функциональной организации
Уровни структурной организации биологических макромолекул
Условно выделяют
макромолекул.
несколько
уровней
структурной
организации
Первичная структура
последовательность звеньев в цепи
биополимера, связанных прочными ковалентными связями.
Высшие уровни организации:
Вторичная структура
локальное упорядочивание (сворачивание)
отдельных участков цепи
Третичная структура
пространственная укладка всей цепи
Четвертичная структура
пространственное расположение
нескольких компактно организованных
полимерных цепей

12.

Биологические макромолекулы, особенности
структурно-функциональной организации
Уровни структурной организации биологических макромолекул
Высшие
уровни
организации
биологических
макромолекул
формируются
и
стабилизируются
(удерживаются)
путем
возникновения большого числа слабых нековалентных объемных
взаимодействий между атомами далеко расположенных в цепи
полимера звеньев.
Взаимодействия, определяющие структуру биополимеров:
силы Ван-дер-Ваальса;
ионные (электростатические) взаимодействия;
водородные связи;
гидрофобные взаимодействия.
Пространственная
структура
белков
стабилизируется
также
формированием S-S мостиков (ковалентных дисульфидных связей
между двумя остатками аминокислоты цистеин).

13.

Биологические макромолекулы, особенности
структурно-функциональной организации
Взаимодействия, стабилизирующие пространственную структуру
биополимеров
Силы Ван-дер-Ваальса
ориентационное
взаимодействие
индукционное
взаимодействие
дисперсионное
взаимодействие

14.

Биологические макромолекулы, особенности
структурно-функциональной организации
Взаимодействия, стабилизирующие пространственную структуру
биополимеров
Водородные связи
Водородная
связь
осуществляется
между
атомом
водорода,
связанным
с
электроотрицательным
атомом кислорода (О), азота
(N), серы (S)
в составе
одной
молекулы,
и
электроотрицательным
атомом,
принадлежащим
другой молекуле.

15.

Биологические макромолекулы, особенности
структурно-функциональной организации
Взаимодействия, стабилизирующие пространственную структуру
биополимеров
Гидрофобные взаимодействия
Определяются
стремлением молекул
воды
сохранить
структуру
и
максимальное
число
водородных связей

16.

Биологические макромолекулы, особенности
структурно-функциональной организации
Взаимодействия, стабилизирующие пространственную структуру
биополимеров
Гидрофобные взаимодействия
Неполярные группы вызывают
нарушение структуры водных
кластеров и формирование
полостей

17.

Биологические макромолекулы, особенности
структурно-функциональной организации
Взаимодействия, стабилизирующие пространственную структуру
биополимеров
Гидрофобные взаимодействия
Самопроизвольность процесса определяет изменение свободной
энергии Гиббса (G , G<0)
G = H - T S
H <
H >
S <
S >
при образовании связей,
при разрыве связей,
при увеличении порядка,
при увеличении беспорядка
Неполярные группы вызывают
формирование
полостей
в
структуре водных кластеров, что
означает
упорядочение,
выключение
из
хаотического
движения
значительного
числа
молекул воды, т.е. уменьшение
энтропии растворителя ( S < ) и
разрыв водородных связей ( H > ).
Свободная
энергия
системы
возрастает
(G ,
G>0),
что
термодинамически невыгодно и
вызывает сворачивание полимера
для уменьшения площади контакта
неполярных групп с водой.

18.

Биологические макромолекулы, особенности
структурно-функциональной организации
Взаимодействия, стабилизирующие пространственную структуру
биополимеров
Дисульфидные связи (S-S мостики)

19.

Биологические макромолекулы, особенности
структурно-функциональной организации
Конформация биологических макромолекул
Конформация макромолекулы это способ укладки полимерной цепи
за счет образования большого количества слабых связей, в результате
чего создается наиболее выгодная и стабильная пространственная
структура макромолекулы.
Нативная конформация это пространственная структура активной
макромолекулы в клетке.
Сворачивание макромолекулы в нативную конформацию фолдинг.
Денатурация нарушение нативной пространственной структуры
макромолекулы под действием различных факторов (температуры, рН
среды, органических и неорганических соединений и т.д.).
Восстановление нативной пространственной
денатурации ренатурация или рефолдинг.
структуры
после

20.

Биологические макромолекулы, особенности
структурно-функциональной организации
Уровни структурной организации белков

21.

Вторичная структура белка
- спираль
-слой

22.

Третичная
структура
белка

23.

Биологические макромолекулы, особенности
структурно-функциональной организации
Конформации ДНК

24.

Биологические макромолекулы, особенности
структурно-функциональной организации
Ионогенные группы биологических макромолекул
COOH
NH3+
OH
SH
HisH+
в составе белков
Состояние и заряд ионогенных групп макромолекул можно
регулировать, меняя состав и рН среды. Это позволяет
регулировать суммарный заряд макромолекул, контролировать
процессы денатурации и ренатурации и используется при
оптимизации технологий выделения и очистки биомолекул.