Методы выявления рецепторов: проточная цитометрия, ИФА

1. ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России Медико-биологический факультет

Методы выявления рецепторов: проточная
цитометрия, ИФА.
Выполнил студент группы 3.4.01
Блескин Дмитрий Алексеевич
Москва 2017

2. Иммунофлуоресцентный анализ

Иммунофлуоресцентный анализ (МФА — метод флуоресцирующих
антител, иммунофлуоресценция) — набор иммунологических методов для
качественного и количественного определения поверхностных и
внутриклеточных антигенов в образцах клеточных суспензий.
Метод позволяет детально анализировать
биологические образцы на присутствие определенных
антигенных детерминант, характерных для
определенных возбудителей или заболеваний,
проводить количественную оценку как
поверхностных так и внутриклеточных белков и
рецепторов.

3.

Принцип иммунофлуоресцентного метода основан на визуальном учете
специфического взаимодействия флуорисцирующих специфических
антител с гомологичным антигеном. Образующийся при этом, комплекс
антиген-антитело, меченный флюорохромом, легко обнаружить по
характерному свечению в сине-фиолетовых лучах люминесцентного
микроскопа.

4.

Методика
Известны прямой и непрямой
методы иммунофлюоресцентного
Растворы
при помощи поршневых пипеток осторожно наносят на препараты, следя за тем,
анализа.
чтобы они были полностью покрыты жидкостью. Инкубацию проводят при комнатной
В прямомвометоде
искомый
антигенный
субстрат
отыскивают
в
температуре
влажной камере
в течение
30 минут. После
инкубации
растворы отсасывают
очень
осторожно,
чтобы не соответствующей
сдвинуть с места соседние
препараты. Отмывают препараты
ткани
посредством
АС.
фосфатно-солевым буфером в кюветах, на аппарате для встряхивания. Буфер меняют с
Непрямой
метод
применяется
определении антител
различной
частотой
в зависимости
от цели при
исследования
На
обезжиренномвпредметном
стекле
из исследуемого
материала
делают
мазки, а из
(антигенов)
жидкостях
или
в том случае,
когда,
кактонкие
упоминалось
органов
тканей
– мазки-отпечатки.
Препараты
подсушивают на воздухе,
фиксируют
выше,инет
подходящей
меченой
антисыворотки.
Специальной
(химические фиксаторы, лучше ацетон).
формой непрямого метода является фиксация комплемента
антителами.

5.

Прямая реакция иммунофлюоресценции
Прямой метод иммунофлюоресцентного анализа
— Препарат отмывают ФСБ в течение 10 минут (однократная
смена буфера), высушивают.
— Инкубируют препарат с различными разведениями
коньюгата.
— Препарат промывают ФСБ в течение 30 минут
(троекратная смена буфера).
— Препарат высушивают и заключают в подходящий
материал.

6. Непрямой метод иммунофлюоресцентного анализа

— Препарат инкубируют с исследуемым
раствором.
— Отмывают ФСБ в течение 20 минут
(двукратная смена буфера).
— Инкубируют с различными разведениями
конъюгата.
— Отмывают в ФСБ в течение 30 минут
(троекратная смена буфера).
— Препарат высушивают, заключают в
подходящий материал.

7. Титрование в шахматном порядке Каждую новую серию конъюгата с целью определения оптимального разведения для непрямого метода

проверяют титрованием в шахматном порядке с позитивными и
негативными контрольными сыворотками.

8. Метод проточной цитометрии

• Проточная цитометрия — метод исследования дисперсных сред
в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по
сигналам светорассеяния и флуоресценции. Название метода
связано с основным приложением, а именно, с исследованием
одиночных биологических клеток в потоке.

9.

Методика
• Суспензия, приготовленная из клеток, предварительно
помеченных флуоресцирующими моноклональными
антителами или флуорохромами, помещается в поток
дисперсионной среды, пропускаемый через проточную
ячейку.
• Гидродинамическое фокусирование струи клеточной
суспензии в струе дисперсионной среды приводит к тому,
что исследуемые клетки или их ядра выстраиваются
поодиночке и в таком порядке пересекают пучок
сфокусированных световых (обычно лазерных) лучей.

10.

• Свет, исходящий от флуорохромов,
фокусируют при помощи оптической
системы, состоящей из нескольких
зеркал и линз, а затем раскладывают
на определенные компоненты.
• Полученные световые сигналы
подвергают анализу и преобразованию
в электрические импульсы, а затем – в
определенные формы, приемлемые
для компьютерной обработки и
хранения полученной информации.

11.

12.

Преимущества метода:
Несомненными преимуществами проточной цитометрии можно считать:
•Высокую (до ста тысяч эпизодов в секунду) скорость выполнения анализа.
•Возможность определения клеточных субпопуляций.
•Способность выполнить анализ огромного (до 108 элементов в одном мл дисперсионной
среды) количества клеток.
•Возможность определения параметров любых клеток и клеточных структур (в том числе и
редко встречающихся).
•Высокую степень объективности в измерении интенсивности свечения (флуоресценции)

13. Спасибо за внимание!