Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

1. Высокоэффективная жидкостная хроматография

2. Высокоэффективная жидкостная хроматография

* Высокоэффективная жидкостная хроматография
представляет собой усовершенствованный метод колоночной
хроматографии (КХ).
* В ВЭЖХ хроматографическое разделение анализируемых
компонентов осуществляется в колонке между неподвижной
и подвижной фазами, которая называется элюентом.
* Неподвижная фаза, состоящая из маленьких пористых
частичек, заполняет колонку.
* Подвижная фаза (элюент) представляет собой растворитель
(смесь растворителей), который подается в колонку под
высоким давлением и протекает сквозь нее с достаточно
высокой скоростью.

3. Высокоэффективная жидкостная хроматография

* Хроматографический метод ВЭЖХ позволяет осуществить
хорошее разделение всех анализируемых компонентов за
короткое время и при оптимальных условиях.
* Так как метод ВЭЖХ является очень распространенным, в
литературе приводятся многочисленные примеры его
применения для решения различных практических задач, на
основании которых пользователь в большинстве случаев
относительно быстро может еще более усовершенствовать
разделение компонентов.
Метод ВЭЖХ может проводиться с использованием различных
видов КХ, таких как:
* адсорбционная;
* ионообменная;
* аффинная;
* гель хроматография

4. Высокоэффективная жидкостная хроматография

* Метод ВЭЖХ является универсальным и применяется во многих отраслях
промышленности.
* Несмотря на достаточно высокую стоимость оборудования, этот метод часто
применяют в исследовательских, научных и промышленных лабораториях.
Он находит широкое применение:
* в аналитической и клинической химии;
* в биохимии;
* молекулярная биология;
* контроль загрязнений окружающей среды;
* в химической;
* нефтехимической;
* пищевой;
* фармацевтической промышленности;
*Условием применения метода ВЭЖХ является
растворимость анализируемой пробы в элюенте.
* Этому условию удовлетворяют практически все органические соединения с не очень
высокой молекулярной массой, не имеющие сшитой структуры.

5. Принцип, лежащий в основе высокоэффективной жидкостной хроматографии

* ВЭЖХ представляет собой процесс хроматографического
разделения, в котором проба распределяется между двумя
фазами в хроматографической колонке.
* В качестве неподвижной фазы (сорбента) выступает
пористый твердый материал с частицами очень
маленьких размеров.
* Подвижная фаза представляет собой смесь растворителей
и протекает через слой сорбента, который заполняет
хроматографическую колонку.
* Разделяемые аналиты с различной скоростью
перемещаются вдоль колонки.
* Компоненты, которые слабее взаимодействуют с сорбентом
и преимущественно остаются в подвижной фазе,
перемещаются вдоль колонки быстрее тех, чья адсорбция
на неподвижной фазе выше.
* Поэтому выбор подвижной и неподвижной фаз имеет
решающее значение

6. Материалы и оборудование, используемое в высокоэффективной жидкостной хроматографии

Комплект оборудования для
проведения ВЭЖХ-анализа
включает в себя следующие
устройства:
*емкость с подвижной фазой;
* насос для создания высокого
давления:
*устройство для дегазации
элюента;
*манометр (датчик давления);
*устройство для ввода проб;
*хроматографическую колонку;
*детектор;
*систему регистрации данных
(интегрирующее устройство или
ПК).

7. Материалы и оборудование, используемое в высокоэффективной жидкостной хроматографии

* Материалы и оборудование, используемое в
высокоэффективной жидкостной
хроматографии
* Принципиально важно различать,
предназначена ли установка для
выполнения изократического либо
градиентного элюирования.
* В хроматографах с изократическим
элюированием концентрация элюента не
изменяется в процессе
хроматографирования.
* Если, например, в качестве подвижной
фазы выбирают смесь метанола и воды (с
содержанием первого 80%). то через
хроматографическую колонку в процессе
ВЭЖХ-анализа должна непрерывно
протекать подвижная фаза именно такого
состава.
* В хроматографах с градиетным
элюированием концентрация элюента в
процессе хроматографирования может
изменяться.
* При градиентном элюировании с
использованием высокого давления
используют два насоса и смеситель (рис.
2.27, 2.28). На рис. 2.29 представлена
блок-схема стандартного изократического
хроматографа.

8. Материалы и оборудование, используемое в высокоэффективной жидкостной хроматографии

* При градиентном элюировании с
*
*
*
*
*
использованием высокого давления
используют два насоса и смеситель (рис.
2.27, 2.28). На рис. 2.29 представлена блоксхема стандартного изократического
хроматографа.
Градиентная система элюирования
применяется в том случае, если некоторые
пики компонентов смеси располагаются
очень близко друг к другу и их необходимо
разделить.
Сначала через колонку пропускают
подвижную фазу, в которой «слабый»
растворитель содержится в большей
концентрации, а затем постепенно повышают
концентрацию более «сильного»
растворителя в составе элюента (рис. 2.30).
Однако в градиентном режиме ВЭЖХанализа применимы не все типы
детекторов (например, нельзя
использовать рефрактометрический
детектор).
При конструировании ВЭЖХ-хроматографов
важно, чтобы длина соединительных
проводов между всеми конструктивными
узлами пробора была минимальной.
Все резьбовые соединения должны быть
плотно закручены для обеспечения их
герметичности

9. Элюенты, применяемые для высокоэффективной жидкостной хроматографии

Подвижная фаза в ВЭЖХ должна обладать определенными свойствами.
*Так, в ее задачу входит обеспечение наиболее быстрого разделения
компонентов пробы, сорбирующихся неподвижной фазой.
*При этом растворитель не должен вступать в химическое взаимодействие с
компонентами проб.
*Кроме того, давление в колонке зависит от вязкости подвижной фазы. При
подаче растворителя, обладающего низкой вязкостью, создается более
низкое давление, чем при использовании растворителя с более высокой
вязкостью, если скорость подачи постоянна.
*Температура кипения растворителей не должна быть очень низкой, так как
при высоком давлении пар образует пузырьки, которые могут препятствовать
нормальному функционированию насосов и детектора.
* При этом растворитель должен быть прозрачным в УФ-диапазоне для
эффективного различения компонентов соответствующим детектором.
*При использовании рефрактометрического детектора показатели
преломления растворителя и анализируемых компонентов должны заметно
различаться.
*Конечно, при выборе растворителя большую роль играют его цена и
токсичность.
*Еще одной характеристикой качества элюента является высокая чистота.

10. Элюенты, применяемые для высокоэффективной жидкостной хроматографии

* Элюенты, применяемые для высокоэффективной
жидкостной хроматографии
* Применение растворителей высокой чистоты позволяет
предотвращать появление помех (пиков посторонних
соединений). Элюент не должен содержать частиц пыли или
прочих загрязнителей, так как такие вещества очень быстро
засоряют колонку, что приводит к резкому возрастанию
давления у нее внутри. Поэтому элюент необходимо
пропускать через мембранный фильтр для очистки от
потенциальных загрязнителей. Исключение составляют
случаи, когда применяют чистые сосуды и новые флаконы с
растворителем.
* Пористый стеклянный фильтр, установленный в емкости с
подвижной фазой, позволяет осуществлять дополнительную
очистку подаваемого на насос потока элюента от примесей.

11. Элюенты, применяемые для высокоэффективной жидкостной хроматографии

* Элюенты, применяемые для высокоэффективной
жидкостной хроматографии
* Необходимо осуществлять «дегазацию» элюента. В особенности
это относится к градиентным методам хроматографического
разделения. Наличие пузырьков газа в элюенте (в большинстве
случаев это растворенный в нем азот воздуха) при снижении
давления или смешивании растворителей может привести к тому,
что пузырьки газа будут выделяться из подвижной фазы, вызывая
«закупорку» оборудования.
* Воздух из элюента вытесняется его дегазацией под действием
ультразвука либо пропусканием гелия через раствор.
* Первый метод не очень эффективен, поэтому сегодня
преимущественно используют специальные дегазаторы, где для
очистки элюента от газа применяется вакуум (пониженное
давление). Пузырьки газа, которые выделяются из элюента при
понижении давления, откачиваются через пленку (мембрану).
Такая мембрана пропускает молекулы газа, а молекулы
компонентов жидкости, имеющие более крупные размеры,
возвращаются обратно в элюент

12. Насосы для высокоэффективной жидкостной хроматографии

Насосы в ВЭЖХ-хроматографах применяют для обеспечения постоянства потока (мл/мин, устанавливается пользователем) подвижной фазы.
Для обеспечения постоянной скорости подвижной фазы в ВЭЖХ-системе
необходимо использовать высокое давление. Разумеется, в тех случаях, когда
колонка заполнена очень мелкими частицами или загрязнена различными
примесями, жидкую фазу необходимо подавать под более высоким давлением,
чтобы элюент мог протекать через колонку с постоянной скоростью.
Примечание
* Объемный поток (в мл/мин) элюента должен представлять собой постоянную
величину. Величина давления, которая используется в хроматографической
системе в таких целях, имеет второстепенное значение. Однако слишком
высокое значение давления свидетельствует о «закупорке» хроматографической
колонки.
* Рабочее давление ВЭЖХ-системы зависит от условий проведения испытаний. При
наполнении колонки неподвижной фазой, размеры частиц dK которой составляют
10 мкм, рабочее давление новой колонки р находится в диапазоне 35-75 бар.
При dK = 3-5 мкм значение р возрастает до 80-200 бар. Кроме того, р зависит от
скорости элюента.
* Необходимая скорость потока для проведения эффективного
хроматографического разделения V зависит от внутреннего диаметра колонки di
и составляет от 0,1 до приблизительно 1,5 мл/мин.
* Максимальное давление насоса составляет около 400-600 бар.

13. Насосы для высокоэффективной жидкостной хроматографии

Насосы в ВЭЖХ-хроматографах применяют для обеспечения
постоянства потока (мл/мин, устанавливается пользователем)
подвижной фазы.
Для обеспечения постоянной скорости подвижной фазы в ВЭЖХ-системе необходимо
использовать высокое давление. Разумеется, в тех случаях, когда колонка заполнена
очень мелкими частицами или загрязнена различными примесями, жидкую фазу
необходимо подавать под более высоким давлением, чтобы элюент мог протекать
через колонку с постоянной скоростью.
Примечание
* Объемный поток (в мл/мин) элюента должен представлять собой постоянную
величину. Величина давления, которая используется в хроматографической системе
в таких целях, имеет второстепенное значение. Однако слишком высокое значение
давления свидетельствует о «закупорке» хроматографической колонки.
* Рабочее давление ВЭЖХ-системы зависит от условий проведения испытаний. При
наполнении колонки неподвижной фазой, размеры частиц dK которой составляют 10
мкм, рабочее давление новой колонки р находится в диапазоне 35-75 бар. При dK = 35 мкм значение р возрастает до 80-200 бар. Кроме того, р зависит от скорости
элюента.
* Необходимая скорость потока для проведения эффективного хроматографического
разделения V зависит от внутреннего диаметра колонки di и составляет от 0,1 до
приблизительно 1,5 мл/мин.
*
Максимальное давление насоса составляет около 400-600 бар.

14. Насосы для высокоэффективной жидкостной хроматографии

*Насосы для высокоэффективной жидкостной
хроматографии
Современные стандартные типы насосов
представляют собой поршневые виды с
коротким ходом, причем применяются
два автономных поршня, так как это позволяет обеспечить низкую пульсацию и
постоянную производительность.
С помощью специальных шаговых
электродвигателей осуществляется
регулирование подачи элюента для
обеспечения постоянного значения
потока.
Шариковые клапаны, расположенные в
насосе, при всасывании открываются и
направляют подвижную фазу в нужном
направлении. Такие поршневые насосы
позволяют обеспечить непрерывную
подачу подвижной фазы без интервалов.
На рис. 2.31 изображена схема
поршневого насоса с коротким ходом.

15. Насосы для высокоэффективной жидкостной хроматографии

* Материалы, из которых изготовлен насос, должны обладать
стойкостью к элюенту, чтобы не загрязнять его.
* Поэтому насосы обычно изготавливают из высококачественной
стали или жесткого полимера ПЭЭК (полиэфир-эфир-кетона).
Поршни, которые должны выдерживать высокое давление,
производят из керамики или такого твердого минерала, как
сапфир.
* В ВЭЖХ к уплотнению поршней предъявляются высокие
требования.
* Современные насосы оснащены «байпассом (обводным
каналом)» для выведения скопившихся внутри пузырьков
воздуха.
* Поскольку многие методы ВЭЖХ-анализа предполагают
применение буферных растворов, которые содержат твердые
буферные соли, достаточно часто приходится осуществлять
«обратную промывку», чтобы отделить образовавшийся осадок
соли, способный привести к повреждению насоса.
* Пользователю необходимо помнить, что насос является
«сердцем» всего ВЭЖХ-хроматографа и что за ним необходимо
тщательно следить.

16. Насосы для высокоэффективной жидкостной хроматографии

* Проведение ВЭЖХ требует постоянства потока.
* Концентрационные детекторы при пульсирующем
объемном потоке подвижной фазы будут регистрировать
изменения площадей пиков, хотя количество
анализируемой смеси, вводимое в устройство для подачи
пробы, остается неизменным.
* Чтобы оценить, обеспечивает ли насос постоянство потока,
многократно вводят смесь одного и того же состава.
* Если времена удерживания и площади пиков различаются
не более чем на 0,5%, то это свидетельствует о постоянстве
потока.
* Если времена удерживания совпадают, а площади пиков —
нет, то причиной этого могут быть неисправности устройств
для ввода пробы: например, их негерметичность.

17. Система ввода образца, применяемая в высокоэффективной жидкостной хроматографии

* Конструкция системы ввода пробы ВЭЖХ-
хроматографа должна обеспечивать
постоянство объема вводимой в колонку
пробы. Обычно этому служит петлевой
дозатор (Loop, или «шестипортовый кран»).
* Прямой ввод пробы ручным способом
невозможен из-за высокого давления в
хроматографе.
* При использовании петлевого дозатора
раствор пробы набирают в шприц с помощью
специальной иглы и вводят в петлю крана, в
которой нет высокого давления;
* затем внутренний корпус поворачивают
таким образом, чтобы попало в поток
элюента.
* Подвижная фаза выталкивает раствор пробы
из петли и перемещает его вдоль колонки.
* При этом объем вводимых в шлейф проб
можно регулировать в пределах от 1 до 1000
мкл.
* Как правило, при проведении ВЭЖХанализа в аналитических целях объем
пробы составляет 10—20 мкл.

18.

* Дозирующая петля крана может быть
заполнена полностью или частично.
* При полном заполнении она предварительно
промывается количеством пробы, в 5-10 раз
превышающим ее объем.
* Если в распоряжении нет такого большого
количества пробы, то петлю заполняют лишь
частично. В этом случае объем вводимой
пробы должен составлять не менее
половины ее максимального объема.
* При вводе раствора пробы важно
предотвратить попадание воздуха в колонку.
Ввод пробы в петлю, которая не находится
под давлением, необходимо осуществлять
медленно и равномерно
* Многие варианты метода ВЭЖХ часто
предусматривают автоматизированную
систему ввода проб («автоматический
дозатор»), которая также функционирует по
принципу петлевого дозатора.
* Однако известно и применение
автоматизированных систем с прямым
вводом проб.

19. Хроматографическая колонка для ВЭЖХ-анализа

* Хроматографическая колонка для ВЭЖХанализа
* Хроматографические колонки варьируют по
длине, внутреннему диаметру и природе
составляющих их материалов.
* На слайде представлена типичная колонка с
внутренним диаметром di = 4,6 мм и длиной l =
12,5 см.
* Типы резьбовых соединений колонок также
различаются. Некоторые колонки устанавливают
в виде картриджей в специальные зажимы.
* В настоящее время распространение получают
короткие колонки длиной 3 см и di пределах 1-2
мм.
* Наиболее высокая разделительная способность
таких колонок достигается при применении
неподвижной фазы с диаметром частиц dk = 3
мкм, когда малые времена удерживания
компонентов успешно сочетаются с высокой
пропускной способностью колонки.
* Однако на данный момент всё еще применяют
стандартные колонки с внутренним диаметром
2-4,6 мм и длиной 5-12,5 см.

20. Хроматографическая колонка для ВЭЖХ-анализа

* Колонки, как правило, изготавливают из
полированной высококачественной стали.
Иногда их делают из ПЭЭК (полиэфир-эфиркетона), который, впрочем, не обладает такой
устойчивостью к высокому давлению, как
сталь.
* Многие колонки промышленного изготовления
в начале и конце снабжены стеклянными
пористыми фильтрами, задерживающими
разного рода загрязняющие частицы.
* Во многих случаях непосредственно перед
колонкой устанавливают защитную, или
«предварительную хроматографическую»,
колонку. Такая защитная колонка
предназначена для насыщения элюента
неподвижной фазой. Неподвижная фаза
предварительной колонки постепенно
растворяется в подвижной фазе (до
насыщения). Вследствие этого неподвижная
фаза основной хроматографической колонки
не разрушается подвижной фазой и время ее
эксплуатации возрастает.
* Предварительная колонка должна быть
заполнена той же неподвижной фазой, что и
основная хроматографическая колонка.
* Кроме того, предварительная колонка играет
роль фильтра.
Хроматографическая колонка
для ВЭЖХ-анализа

21. Хроматографическая колонка для ВЭЖХ-анализа

Хроматографическая колонка для ВЭЖХанализа
Внутренний диаметр колонки имеет решающее значение для выбора объемного
потока элюента. Этот параметр следует рассчитывать таким образом, чтобы
значение средней линейной скорости потока U составляло 6-12 см/мин. При
значении объема потока V, например, 1,5 мл/мин в колонке с внутренним
диаметром d, от 4 мм в соответствии с уравнением (2.22) значение U составит
около 12 см/мин.
*Путем преобразования (2.21) можно рассчитать значение U:
*Если теперь вместо колонки с di = 4 мм необходимо использовать новую
колонку с di = 2 мм, то следует проводить расчеты с использованием подобных
времен удерживания при условии, что значение линейной скорости U не
изменяется. Если же значение di составляет 2 мм, а значениеU— 12 см/мин, то
в соответствии с (2.23) необходимо установить значение объемного потока,
равное 0,4 мл/мин:

22. Хроматографическая колонка для ВЭЖХ-анализа

Хроматографическая колонка для ВЭЖХанализа
Это также означает, что расход элюента существенно снижается и
одновременно с этим увеличивается предел обнаружения, так как масса пробы
анализируемого компонента распределяется в существенно меньшем
количестве элюента. При дальнейшем уменьшении внутреннего диаметра di
необходимо использовать специальные насосы и детекторы, чтобы обеспечить
постоянство потока элюента.
Существуют несколько приемов, позволяющих увеличить срок работы
ВЭЖХ-колонки. Прежде всего, следует обратить внимание на следующие
моменты:
*хроматографическую колонку необходимо промыть большим количеством
элюента перед проведением анализа пробы (т. е. осуществить
«кондиционирование» колонки);
* следует предотвратить возможное загрязнение элюента и раствора пробы;
* ВЭЖХ-колонки очень плохо переносят сильные колебания давления,
поэтому их необходимо исключить. В первую очередь следует
предотвратить попадание пузырьков газа в ВЭЖХ-систему;
* если в качестве элюента применялся буферный раствор (в обрашеннофазовой хроматографии), то колонку следует промыть теплой водой для
удаления остатков буферной соли;
* нельзя использовать растворы, значения рН которых выше или ниже
установленных для данной колонки изготовителем.

23. ХРАНЕНИЕ, РЕГЕНЕРАЦИЯ И РЕМОНТ КОЛОНОК ДЛЯ ВЭЖХ

* Колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии являются тонким
инструментом, сердцем хроматографа и требуют бережного обращения.
* Ошибка оператора прежде всего сказывается на колонке; она может полностью или
частично потерять свои качества в результате превышения давления, ввода
нефильтрованного растворителя или пробы, неосторожного удара, слишком
сильной затяжки резьбы и т.д. Поэтому правильному хранению колонок, их
регенерации и ремонту необходимо уделять внимание.
* Хранения колонок. Фирмы, производящие тестированные и не тестированные,
а также пустые колонки для ВЭЖХ поставляют их в специальных коробках, имеющих
мягкий пенополиуретановый вкладыш с гнездом для колонки или такие же
прокладки. Иногда колонку дополнительно помещают в трубку из пластика и
фиксируют на концах держателями.
* Концы колонки герметично закрывают заглушками разного типа,
предотвращающими высыхание сорбента.
* На самой колонке есть спецификация, в которой даны каталожный и порядковый
номер колонки, ее размеры, сорбент и его зернение, направление потока
растворителя и другие данные. Если колонка тестирована, то в коробке лежит тестхроматограмма с условиями испытания колонки и его результатами, если не
тестирована, то, как правило, инструкция по тестированию.
* Хранить колонку желательно в коробке, в которой она получена; в ней же следует
хранить всю соответствующую информацию. Желательно перенумеровать все
колонки и на каждую завести паспорт, в котором следует отмечать все виды
анализов и растворителей, примерную длительность работы, давление при работе и
другие сведения. Хранить все коробки с колонками желательно в одном месте,
надежно защищенном от ударов, вибрации, нагрева.

24. ХРАНЕНИЕ, РЕГЕНЕРАЦИЯ И РЕМОНТ КОЛОНОК ДЛЯ ВЭЖХ

* Перед началом эксплуатации новой колонки следует прежде всего
снять и положить в коробку заглушки, так как они для разных
колонок разные, и если будут перепутаны — нарушится
герметичность при последующем использовании. Коробка должна
иметь ту же маркировку, что и сама колонка. Всегда желательно
провести ретестирование колонки в тех же условиях, в которых ее
тестировали. Это позволяет установить, не потеряла ли колонка
эффективность при транспортировке, проверить эффективность
вашей хроматографической системы в целом (по сравнению с
системой, использованной фирмой-производителем) и получить
свою тест-хроматограмму для новой колонки, которая служит
эталоном при следующих проверках в процессе эксплуатации
колонки.
* Если вы переходите на новую систему растворителей, уточните,
каким растворителем заполнена колонка — это обычно указывает
фирма-изготовитель или отмечено в паспорте колонки. Помните о
возможности образования гетерофазной системы при смене
растворителя, всегда используйте в сомнительных случаях
промежуточные, полностью смешивающиеся растворители,
например изопропанол.

25. ХРАНЕНИЕ, РЕГЕНЕРАЦИЯ И РЕМОНТ КОЛОНОК ДЛЯ ВЭЖХ

* После работы колонку следует подготовить к хранению: ее промывают
и заполняют растворителем для хранения (для обращенно-фазных
сорбентов—метанолом, для силикагеля—гексаном или гептаном, для
ионообменников — метанолом, для других колонок—по рекомендации
фирмы-производителя). Промытую колонку герметично закрывают
заглушками и помещают в коробку для хранения, сделав запись в
паспорте о проведенной работе и растворителе для хранения.
Помните, что колонка без паспорта (особенно пролежавшая какое-то
время) практически бесполезна, ибо установить ее сорбент
невозможно или требует большого труда. Особенно следует
предостеречь от спешки при смене колонок, когда, не убрав одну
колонку, достают другую для установки, кладут рядом, чем-то
отвлекаются и... не могут вспомнить, какую колонку нужно поставить,
а какую колонку убрать.
* Регенерации колонок, под которой понимают восстановление
разделительных и эксплуатационных характеристик колонки,
потерянных в процессе эксплуатации. Утрата первоначальных
характеристик колонки проявляется в заметном увеличении рабочего
давления при том же потоке, в ухудшении разделения пиков за счет
потери эффективности, появлении хвостов пиков, изменении порядка
выхода компонентов, в резком уменьшении или увеличении времени
удерживания компонентов и т.д.

26. ХРАНЕНИЕ, РЕГЕНЕРАЦИЯ И РЕМОНТ КОЛОНОК ДЛЯ ВЭЖХ

* ХРАНЕНИЕ, РЕГЕНЕРАЦИЯ И РЕМОНТ КОЛОНОК ДЛЯ ВЭЖХ
* Как правило, колонка утрачивает свои свойства в процессе
эксплуатации в силу следующих причин.
* Во-первых, это нарушение допустимых параметров работы колонки по
потоку и давлению растворителя, возникающее из-за ошибок оператора
(неправильная задача расхода, использование высоковязких
растворителей и т. п.). При этом, если давление превысит значение,
использовавшееся при набивке колонки, сорбент неизбежно
уплотнится, просядет, в начале колонки появится пустота (мертвый
объем), пики будут размываться и эффективность колонки будет
утрачена.
* Во-вторых, это ошибки оператора, связанные с выбором растворителя,
т.е. использование растворителя с рН ниже 3 или выше 8. В этом
случае происходит ускоренное разрушение, особенно при повышенных
температурах, силикагелевой матрицы с растворением силикагеля,
уменьшением его механической прочности, химическим отщеплением
привитой фазы. Изменение природы сорбента, естественно, меняет
параметры, удерживания веществ и приводит к нарушению
хроматографического процесса, а также к проседанию сорбента в
начале колонки из-за ухудшения его прочности.
*
.

27.

* В-третьих, это загрязнение входного фильтра колонки частицами,
попадающими в поток вследствие применения нефильтрованных
растворителей, содержащих взвеси проб, а также появляющихся за
счет износа уплотнений поршней, клапанов, инжектора. Это
приводит к уменьшению числа пор фильтра, росту его
гидравлического сопротивления и возрастанию давления на
колонке. Необходимо фильтровать растворители и пробы и
устанавливать дополнительные фильтры в линии для улавливания
частиц, образующихся в процессе работы поршней, клапанов,
инжектора.
* В-четвертых, это химическое загрязнение колонки. Его избежать
полностью не удается, так как даже высокочистые растворители
для ВЭЖХ, не говоря о технических видах, содержат некоторое
количество примесей, продуктов фотохимической и окислительной
деструкции растворителей, их стабилизаторов, примесей, тары и
др. К «химическому» загрязнению, изменяющему параметры
удерживания, приводит использование силикагеля, а в качестве
подвижной фазы — влажного гексана или гептана, постепенно
«загрязняющих» безводный силикагель водой

28. ХРАНЕНИЕ, РЕГЕНЕРАЦИЯ И РЕМОНТ КОЛОНОК ДЛЯ ВЭЖХ

* ХРАНЕНИЕ, РЕГЕНЕРАЦИЯ И РЕМОНТ КОЛОНОК ДЛЯ ВЭЖХ
* Регенерацию вышедшей из строя колонки (в отличие от ремонта колонки)
проводят без снятия концевых фитингов.
* Выбирают комплекс растворителей и химикатов, который позволяет
удалить нежелательные загрязнения с сорбента и фильтров химическим
или физико-химическим воздействием.
* Регенерация успешна только в том случае, если в процессе эксплуатации
колонки не произошло физической или химической деградации слоя
сорбента, т. е. образования каналов, пустот или отщепления привитой
фазы.
* Первый вопрос, который возникает при регенерации, — это можно ли для
ускорения и улучшения процесса изменить направление потока через
колонку, чтобы загрязнения с сорбента и фильтра на входе сразу
удалялись, не проходя через весь слой сорбента.
* Вопрос не праздный, так как некоторые опытные специалисты считают это
возможным, а другие решительно отрицают, указывая на возможность
нарушения плотности упаковки, образования каналов и т.д.
* Фирмы-производители также не единодушны: некоторые считают
изменение направления потока через колонку опасным; другие, напротив,
рекламируют свои колонки как способные работать при любомнаправлении потока; третьи даже не указывают для своих колонок
направления потока, полагая, что это безразлично.

29. ХРАНЕНИЕ, РЕГЕНЕРАЦИЯ И РЕМОНТ КОЛОНОК ДЛЯ ВЭЖХ

* ХРАНЕНИЕ, РЕГЕНЕРАЦИЯ И РЕМОНТ КОЛОНОК ДЛЯ ВЭЖХ
* Какими растворителями и в какой последовательности вести
регенерацию колонок—это зависит от типа сорбента и от
предполагаемых загрязнений, которые следует удалить.
* Имеется много рекомендаций, какие растворители, в какой
последовательности и для каких сорбентов использовать, однако
никто лучше хроматографиста не знает, какие загрязнения он
«посадил» на колонку и какой растворитель пригоден для их
удаления.
* Если загрязнениями являются соли, то для их удаления лучше всего
вода, если полимеры — хлороформ или тетрагидрофуран, если вода
— безводные спирты, хлоруглеводороды и т.д.
* Для трудноудаляемых загрязнений, особенно биологических,
используют диметилформамид, диметилсульфоксид, сильные
буферные растворы.
* Не следует забывать о принципе полной смешиваемости
последующего и данного растворителей, иначе возможно
образование гетерофазных систем.
* Если в результате регенерации не удалось восстановить
работоспособность колонки, следует попытаться провести ее
ремонт.

30. Неподвижные фазы, применяемые в высокоэффективной жидкостной хроматографии

* Чтобы обеспечить высокую эффективность разделения компонентов,
необходимо использовать неподвижную фазу с очень маленькими
размерами частиц.
* Вследствие этого увеличивается активная поверхность неподвижной фазы.
* С помощью применения маленьких частиц улучшается диффузия пробы, а
также процессы сорбции в колонке.
* Недостатком использования очень маленьких частиц сорбента является
чрезмерное увеличение давления, что снова ведет к повышению требований,
предъявляемых к насосу.
* Огромное значение имеет и форма частиц. Следует отметить, что в том случае,
если размеры частиц сорбента являются одинаковыми, а форма частиц —
идеально круглой, то подвижная фаза может легче перемещаться вдоль
неподвижной.
* На данный момент стандартный размер частиц неподвижной фазы dK составляет
5 мкм. Тем не менее наблюдается тенденция увеличения использования частиц
с dк = 3 мкм.
* Выбор неподвижной фазы, как правило, продиктован ее химическим строением.
На практике наилучшее разделение наблюдается при применении:
* материалов для нормально-фазовой (НФ) хроматографии;
* материалов для обращенно-фазовой (ОФ) хроматографии;
* других материалов.

31. Нормально-фазовая ВЭЖХ

*
* При нормально-фазовой ВЭЖХ
(НФВЭЖХ) в качестве
неподвижной фазы применяют
силикагель.
* На поверхности силикагеля
равномерно распределены так
называемые силанольные группы
(рис. 2.34).
* Если полярная молекула
находится вблизи силанольной
группы, то между ними может
возникать слабая физическая
«связь». Образование такие
слабых «связей» называют
адсорбцией, разрушение —
десорбцией

32. Нормально-фазовая ВЭЖХ

*Нормально-фазовая ВЭЖХ
* Перед образованием таких связей участки неподвижной
фазы, обладающие различной активностью, заполнены
молекулами компонентов элюента.
* Молекула аналита адсорбируется только в том случае, если
ее взаимодействие с активными участками неподвижной
фазы сильнее, чем с элюентом.
* Функциональная группа молекулы анализируемой пробы
располагается на адсорбирующей поверхности, причем
алкильный остаток всегда максимально удален от полярной
поверхности сорбента.
* Более высокая степень разделения компонентов достигается
при проведении НФВЭЖХ.
* Однако НФ-адсорбент не применим для разделения
соединений, содержащих различные по величине
алифатические фрагменты молекул, поэтому эффективность
НФ-хроматографии при разделении, например, смеси
бутанола, пентанола и октанола оказывается очень низкой.

33. Нормально-фазовая ВЭЖХ

*Нормально-фазовая ВЭЖХ
В качестве элюента в НФВЭЖХ используются
неполярные растворители, такие как:
* n-гексан,
* n-гептан
*этиловый эфир уксусной кислоты.
Содержание влаги в элюенте имеет большое значение, так
как даже незначительное колебание содержания воды
вызывает существенные изменения в значении времен
удерживания.
В качестве элюента в НФВЭЖХ применяют неполярные
растворители.

34. Обращенно-фазовая хроматография

* Если неподвижная фаза обладает меньшей полярностью,
чем подвижная, то такой тип хроматографии называют
обращенно-фазовой хроматографией (ОФХ).
* Такой тип хроматографии предусматривает использование
полярных растворителей, таких как вода, метанол,
ацетонитрил и тетрагидрофуран.
* Органические компоненты также часто называют
«модификаторами».
* В качестве элюента в НФВЭЖХ применяют полярные
растворители.

35. Обращенно-фазовая хроматография

*Обращенно-фазовая хроматография
* В качестве неподвижной фазы используют химически
модифицированный силикагель, который еще называют ОФматериалом. Такой силикагель является неполярным и образуется
при взаимодействии свободных ОН-групп силикагеля с
предельными силильными производными.
* В зависимости от длины алкильного фрагмента модифицирующего
силильного производного образуется слабополярный (неполярный)
материал с большей или меньшей степенью полярности.
* Как правило, в ОФВЭЖХ применяют вещества, содержащие
алкильные заместители с 8 или 18 атомами углерода, т. е. длина
углеродной цепи фрагмента молекулы замещенного силикагеля
составляет С = 8 или С = 18. При этом силикагели с привитой
цепью, содержащей 18 атомов углерода, обладают наименьшей
полярностью по сравнению с силикагелем с привитой цепью, где
атомов углерода только восемь.
* Таким образом, из длинных цепочек образуются «щетки», которые
отдаляют поверхность зерен сорбента неподвижной фазы от
анализируемой пробы.

36. Обращенно-фазовая хроматография

*Обращенно-фазовая хроматография
* С позиций стереохимии в такое
взаимодействие могут вступать не все типы
кремний содержащих соединений.
* Например, свободные, не вступившие во
взаимодействие силанольные группы при
анализе основных молекул ведут себя как
ионообменники и прочно удерживают
основные аналиты в течение достаточно
продолжительного времени.
* Результатом таких процессов является
появление на хроматограмме очень широких
искаженных пиков («химическая
асимметрия»).
* Производители неподвижных фаз,
используя химическое взаимодействие с
силильными производными с алкильными
фрагментами маленького размера,
стремятся по возможности блокировать
большое количество свободных силанольных
групп (см. рис. 2.35). Этот процесс называют
«блокированием концевых групп».
* Если необходимо осуществить разделение
полярных компонентов с использованием
ОФ-фазы, то с помощью буферной системы
устанавливается соответствующее значение
рН.

37. Обращенно-фазовая хроматография

*Обращенно-фазовая хроматография
* В настоящее время многие изготовители неподвижных фаз
прививают на ОФ-фазы выбранные функциональные группы
(например, такие как -NH-), которые модифицируют свойства
неподвижных фаз.
* Химическая модификация силикагеля, к сожалению, еще не
является достаточно устойчивой.
* При значениях рН ниже 2 и выше 10 привитые группы
гидролизуются и растворимость неподвижной фазы в элюенте
становится существенно выше. Поэтому следует внимательно
прочесть все справочные данные, предоставляемые
изготовителями колонок, в которых приводится информация о
критических условиях их эксплуатации.
* Иногда ОФ-колонки необходимо промывать чистым ацетонитрилом
или тетрагидрофураном. Если использовали буферный раствор, то
перед следующим применением колонку следует промыть теплой
водой для очищения от буферной соли.

38. Обращенно-фазовая хроматография

*Обращенно-фазовая хроматография
* С использованием ОФВЭЖХ можно проводить разделение
преимущественно неполярных, неионных анализируемых
соединений.
* Метод может применяться и для разделения ионных
веществ, если анализируемые компоненты в пробе
представляют собой слабые протонные кислоты или
основания.
* Варьированием величин рН такие компоненты можно
перевести в практически недиссоциированные
соединения.

39. Специальные материалы, применяемые в высокоэффективной жидкостной хроматографии

* Специальные материалы, применяемые в
высокоэффективной жидкостной хроматографии
* С помощью ионообменной хроматографии можно осуществить
разделение кислот и оснований с высокой степенью диссоциации.
* В ионообменной хроматографии в подвижную фазу вводятся
органические и ионные компоненты, заряд которых противоположен
заряду ионов анализируемых компонентов. Таким образом образуются
«ионные пары».
* Фактически они представляют собой соли, однако процесс их
хроматографического разделения не вызывает каких-либо затруднений,
поскольку они ведут себя как неполярные соединения.
Примером типичных соединений, образующих ионные пары, являются:
* для основных анализируемых проб — алкилсульфокислоты,
* например С12Н23-SO3H;
* для кислотных анализируемых проб — соли тетраалкиламмония,
* например (C2H5)4N+HS04-.
В качестве неподвижной фазы применяют стандартные ОФ-колонки.

40. Специальные материалы, применяемые в высокоэффективной жидкостной хроматографии

Гель-хроматография (эксклюзионная хроматография) принципиально
отличается от всех других типов хроматографии.
* В основе процесса разделения лежит не неодинаковое взаимодействие
между компонентами проб и неподвижной фазой, а принцип различения
молекул по их размерам.
* Молекулы компонентов, размер которых больше диаметра пор геля,
быстрее перемещаются вдоль колонки, чем маленькие молекулы
компонентов, которые могут удерживаться в порах геля. В результате такие
удерживаемые компоненты элюируются позднее других. При этом сам
растворитель не должен вступать во взаимодействие с неподвижной фазой.
Однако такой процесс является достаточно длительным и до того, как все
анализируемые компоненты покинут колонку, может пройти 1 ч.
*При применении любых типов хроматографических колонок постоянство
температуры элюента имеет крайне важное значение, так как в противном
случае происходит изменение времен удерживания компонентов.
*Обеспечить постоянство температуры можно с помощью «термостата
колонок», который устанавливают в хроматограф. Также можно увеличить
скорость хроматографического разделения компонентов, если проводить
процесс при повышенной (приблизительно до 40 °С) температуре. Однако
при этом возрастает опасность образования пузырьков пара.