Микробиологическая диагностика холеры

1. Ставропольский государственный медицинский университет

Кафедра микробиологии
Занятие 5
Тема занятия:
Микробиологическая диагностика
холеры.

2.

План занятия
I. Вопросы для обсуждения
1. Обсуждение теоретических и практических вопросов по теме занятия по
общепринятой схеме.
II. Практическая работа:
1. Демонстрационный материал:
а) стенд: «Возбудители холеры»;
б) морфология холерного классического и холерного вибриона Эль-Тор в мазках.
в) дифференциальные признаки вибрионов: холерного классического, холерного
Эль-Тор, холероподобного;

3.

2. Исследование воды на холеру. Бактериологический метод:
- методика взятия пробы из воды, материала от больного с подозрением на
холеру, из трупа. Патрон для пересылки фекалий;
- изучение колоний холероподобного вибриона на щелочном агаре,
приготовление мазков, окраска по Граму;
- биохимические свойства и реакция холера-рот;
- серодиагностика холерных вибрионов, постановка развернутой реакции
агглютинации с «О» холерной сывороткой, учет результатов;
- ускоренная диагностика холеры по Ермольевой, учет результатов;
3. Биопрепараты: вакцина, агглютинирующие сыворотки, Инаба, Огава, Гикошима,
бактериофаг, холероген -анатоксин.

4.

III.Вопросы для самоподготовки:
а) Каковы морфологические, культуральные и биохимические особенности
холерного вибриона?
б) По каким признакам отличают холерный вибрион от холероподобного?
в) Как происходит заражение при холере?
г) Монофаги холерные жидкие (2 мл), состав назначение.
д) Принцип патогенеза диареи при холере.

5.

I.
Характеристика возбудителя
1. Заболеваемость холерой с древнейших
времен регистрируется на полуострове
Индостан, особенно в период военных
действий. В Европу и Россию холера
проникла через Ближний Восток, Египет.
В 1883 году Р. Кохом был открыт
холерный вибрион («запятая
Коха»),благодаря применению
питательных плотных сред (желатин на
стеклах). А в 1906 году в Египте Ф. и Е.
Готшлихами на карантинной станции
Эль-Тор из трупов паломников –
мусульман, умерших при явлении
диареи, был выделен биовар холерного
вибриона (вибрион Эль-Тор)

6. Холера

• Острое инфекционное заболевание,
характеризующееся поражением тонкой
кишки, нарушение водно-солевого обмена ,
интоксикацией, что выражается обильными
поносами с быстрой потерей жидкости,
солей, ведущих к обезвоживанию
организма и нередко смерти.

7.

2. Семейство: Vibrionaceae
Род: Vibrio
Виды: V. cholerae биовар -cholerae
V. cholerae биовар –eltor
V. cholerae серовар О 139.
3. Морфология. Холерный вибрион грамотрицательная палочка в форме
запятой, длиной 2-4 мкм, толщиной 0,5
мкм. Не образует спор и капсулы,
монотрих (полярно расположенные
жгутики), чрезвычайно подвижен.

8.

Культуральные свойства. Является
факультативным анаэробом, но
предпочитает аэробные условия роста,
поэтому на поверхности жидкой
питательной среды образует пленку.
Холерный вибрион неприхотлив в
росте и может расти на простых средах.
Оптимальная температура роста 37 С и
рН 8,5-9,0. Для оптимального роста
требует присутствия в среде 0,5%
натрия хлорида. Средой накопления
является 1% щелочная пептонная вода,
на которой он образует пленку в
течение 6-8 ч. Элективной средой
является TCBS-среда (тиосульфатцитратный сахарозо-желчесодержащий
агар), на котором образует колонии
желтого цвета.

9.

Биохимические свойства. Биохимически
активен. Оксидазоположителен. Обладает
протеолитическими и сахаролитическими
свойствами: продуцирует индол,
лизиндекарбоксилазу, разжижает в
воронковидной форме желатин,
сероводород не продуцирует.
Ферментирует глюкозу, сахарозу, маннозу,
крахмал, лактозу (мед- ленно).
Не сбраживает рамнозу, арабинозу, дульцит, инозит, инулин. Обладает
нитратредуктазной активностью. Холерные вибрионы различаются по
чувствительности к бактериофагам.
Нитрозо - индоловая реакция – реакция «холера-рот»
(позволяет косвенно определить синтез возбудителями
оксидазы, протеолитических ферментов, декарбоксилазы,
способность восстанавливать находящиеся в среде нитраты и
выделять из белка среды индол, который окрашивает ее в
красный цвет после добавления H2SO4).

10.

H2SO4
Нитрозо – индоловая
реакция (красный цвет)
KNO3 → 2KNO2 + H2SO4 = K2SO4 +
Восстановлению
нитратов в нитриты
Триптофан
Способствует
Ферментирует
белок
Оксидаза
Протеолитическ
ие ферменты
V. Cholerae (или -eltor
Декарбок
силаза

11.

Резистентность.
К дезинфектантам
(хлор, хлорамин и
др.) – через 15-30
мин
К действию прямых
солнечных лучей
К высушиванию
Чувствительны
К
80○
К 100○ С – через
10-30 сек
С через 5 мин
В морской воде – 47
суток
Устойчивы
Во льду – до 1
мес
В свежых
испражнениях –
до 3 суток
На сырых овощах,
фруктах – до 5
В почве – до 3
мес
В молоке и
молочных
продуктах – до
3 суток

12.

Антигенная структура.
Н - АГ
Отсутствуют
сочетания
ферментов,
характерных для
холерных
вибрионов
Холерный вибрион
Термолабильные
Нехолерные
вибрионы
Группа А
Антигены
Группа В
Синтезируют
ферменты,
расщепляющие
сахарозу, маннозу,
но не арабинозу
Триада Хейберга
Термостабильные
О - АГ

13.

Холерные
вибрионы
О - АГ
01 серовар
V. cholerae
classic-0,1
139 сероваров
V. cholerae
Eltor-0,1
0,2;0,3;0,4 и
др. серовары
Нехолерные
вибрионы
Серовары
Огава
Инаба
Гикоши
ма
AC
AB
ABC
Сочетания
компонентов 01АГ
0139 серовар
V. cholerae 0139

14.

Факторы
Подвижность
Проникновени
е через
слизистый
слой к
эпителиальны
м клеткам
Адгезия
Колонизация
Прикрепление
к
эпителиальны
м клеткам
Размножение,
распространен
ие по
поверхности
эпителия
Эндотоксин
(ЛПС-стенка
клетки)
Токсины
Экзотоксин
(белок)
Факторы
проницаемост
и
Усиливает
проницаемость
капилляров
Способствует
выходу солей
и жидкости в
просвет
кишечника
Диарея

15.

Выделяется
в процессе
жизнидеяте
льности
бактерий
Эндотоксин
(ЛПС-стенка
клетки)
Компоненты
(пептиды)
В
А2
Связывается с
рецепторами
эритроцита и
формирует
внутримембранн
ый канал для
прохождения
пептида А1
А1
Связвает
А1 и В
Стимулирует
выход солей и
жидкости в
просвет
кишечника
Выделяется
при
разрушени
и бактерий
Экзотоксин
(белок)
Не играет
существенной
роли в развитии
характерных для
холеры
проявлений
Выполняет
токсическую
функцию
Диарея
Вызывает
образование
вибриоцидных
антител

16.

II. Эпидемилогия. Холера- это острая кишечная инфекция с фекально-оральным
механизмом передачи. Наиболее распространенным путем передачи является
водный, пищевой, реже —контактно-бытовой. Определенную роль в
распространении холеры играют мухи. Эпидемии могут протекать в виде острых
вспышек заболеваний и в виде вялотекущих эпидемий с постоянно регистрируемой
заболеваемостью, но не с такой высокой интенсивностью. Источник инфекции —
больной человек или вибрионоситель. Резервуаром инфекции является также
водная среда. Животные к возбудителю холеры нечувствительны. Факторами
передачи могут служить пресная и морская вода, пищевые продукты (молочные,
овощи, фрукты, гидробионты), объекты окружающей среды. Большую роль играет
несоблюдение правил личной и коммунальной гигиены. Подъем заболеваемости
обычно отмечается в теплый, влажный сезон, что связано с лучшей сохраняемостью
возбудителя в окружающей среде, обилием мух, скученностью населения.

17.

Холера известна с древних времен. Но до
начала XIX века она встречалась только в
Индии, где в устье рек Ганг и Брахмапутра
расположен гиперэндемический очаг этого
заболевания. В 1817 г. распространение холеры
вышло за пределы этого гиперэндемического
очага и достигло Европы и Америки. С 1817 по
1926 г. человечество пережило 6 пандемий
холеры, вызванных классическим биоваром. В
1961 г. началась 7-я пандемия, причиной
которой является биовар Эль-Тор. В декабре
1992 г. в Бангладеш началась эпидемия холеры,
которая была вызвана V. cholerae О139 Bengal,
который является генетическим дериватом
пандемического штамма Эль-Тор с измененной
антигенной структурой. Эпидемия, вызванная
этим штаммом, в последующем
распространилась на другие страны,
спорадические случаи заболеваний были
зафиксированы и в России

18.

III. Краткая характеристика заболевания
Патогенез.
Входные ворота
Ротовая полость
Факторы,
способствующие
адгезии
Синтезируемые
вибрионами
ферменты:
муциназа,
нейраминидаза,
протеаза,
лецитиназа
Эндотоксин
Гибель части
вибрионов в кислой
среде желудка
Поступление в
тонкую кишку
выживших
вибрионов
Адгезия,
размножение,
колонизация на
слизистой тонкой
кишки
Выделение
Факторы,
способствующие
размножению
Щелочная среда в
просвете тонкой
кишки и наличие
высокого
содержания
пептонов
Экзо(энтеро)тоскин

19.

Клинические проявления. Инкубационный период
варьирует от нескольких часов до 5 дней (в среднем 2-3
дня). Клинически холера проявляется в виде боли в
животе, тенезмы, рвоты, диареи. Тяжелый больной в
сутки выделяет до 30 л жидкости. Стул носит характер
«рисового отвара», т. е. бесцветные обильные
испражнения со сладковатым запахом (не фекальный).
Помимо клинической картины энтерита (или
гастроэнтерита) в тяжелых случаях может развиваться
почечная недостаточность, афония, гипотензия,
сердечная недостаточность, гипотермия («холерный
алгид»). При неправильном лечении летальность при
алгиде достигает 60 %.

20.

Иммунитет.
Иммунитет
Постинфекционный
Антитоксический
Антибактериальный
Прочны-до 3 лет
Антибактериальные
Сывороточные
антитела
В начале
заболевания
Существенная роль
в защите
В разгар
заболевания
АГ полисахаридного
комплекса
Направленные в
основном против
АГ субъединицы
«В» холерного
токсина
Секреторные Ig АТ,
синтезируемые в
кишечнике
реконвалесцентов
Нейтрализуют
токсин
(энтеротоксин) до
его взаимодействия
с рецепоторами
слизистой тонкого
кишечника
Препятствует
прикреплению
возбудителя к
микроворсинке
слизистой тонкой
кишки
Иммунитет
непрочный
Антитоскические

21.

IV. Микробиологическая диагностика.
Исследуемый
материал
Испражнения, рвотные массы, вода,
пищевые продукты, патологоанатомический материал
Методы
Бактериоскопическое
исследование
Экспресс-методы
диагностики
Бактериологическое
исследование

22.

Бактериоскопическое исследование
Мазок,
Окраска
по методу Грама
Нативный препарат,
темнопольная
микроскопия
Ориентировочное заключение

23.

Экспресс-методы диагностики
Иммобилизация
вибрионов
Иммунохимические
исследования:
иммунофлюоресцентная
микроскопия
Предварительный ответ
Биохимические и
молекулярнобиологические
исследования: ПЦР

24.

Экспресс-методы диагностики
Фогес-Проскауэр – холеру выращивают в глюкозо-фосфатном
бульоне, затем добавляют т-реактивный ά-пафтол. При наличии
ацетилметилкарбинола появляется рубино-красное окрашивание.
РИФ

25.

Метод ускоренной диагностики
(метод Ермольевой)
Пептонная вода1%
В термостат на 3-4 ч.
При росте бактерийголубая пленка
Пептонная вода1%
+ О-холерная сыворотка
В термостат через 5-6 ч.
Взаимодействие с О-АГвыпадает хлопьевидный
осадок
Пептонная вода1%
+ крахмал
Происходит ферментация крахмала
Это свидетельствует о наличие О-сыворотки в пробирке
+ I2 нет синего цвета

26.

Бактериологическое исследование
Исследуемый
материал
Посев на
1% пептонную воду
В термостат
при t=37 C
на 3-4 часа

27.

I.
II.
Макроскопия
III.
Посев на
щелочной агар
Микроскопия

28.

I.
Макроскопия
III.
II.
Пересев на скошенный
агар для накопления
чистых культур
Микроскопия

29.

I.
II.
Макроскопия
Микроскопия
Идентификация:
III.
1.
2.
3.
4.
По биохимическим признакам
По чувствительности к фагам
По антигенным свойствам
По токсичности