Почва-Холоднова

1.

Влияние загрязнения окружающей среды
на формирование антибиотикорезистентности
у почвенных микроорганизмов
Выполнила:
Холоднова Мария Константиновна,
ученица 11 класса,
МБОУ «Гимназия №4» г. Смоленска
Руководитель:
Васильцова Оксана Николаевна,
заслуженный учитель РФ, преподаватель биологии
Научный консультант:
Эйдельштейн Инна Александровна,
к.б.н., НИИ антимикробной химиотерапии ГОУ ВПО СГМУ

2.

Актуальность работы
Антибиотики попадают в почву из:
сельскохозяйственных стоков
сточных вод
промышленных отходов
органических удобрений (помёт, навоз)

3.

Цель:
изучить
показатели
антибиотикорезистентности
почвенных
бактерий в пробах, собранных в зоне интенсивного антропогенного
воздействия.
Задачи:
1. Отбор почвенных проб для исследования в разных локациях города
Смоленска: на территории птицефабрики, больницы, берега реки Ясенной
и парковой зоны.
2. Изучение видового состава микроорганизмов сообщества почвы.
3. Определение антибиотикорезистентности почвенных бактерий.
Гипотеза: почвы в зоне влияния объектов, использующих антибиотики
(содержащие
в
микроорганизмы.
качестве
стоков),
могут
содержать
резистентные

4.

Устойчивость к антибиотикам
Антибиотикорезистентность - это способность микроорганизмов (в данном случае
почвенных бактерий) противостоять действию антибиотиков, которые обычно их
убивают или подавляют.
Микроорганизмы, обладающие природной
устойчивостью получают преимущество в
выживании и размножении, что способствует
распространению устойчивых штаммов.
К механизмам устойчивости бактерий относят
вырабатывание ферментов, разрушающих
антибиотики, наличие мутаций в структурах
клетки, изменение структуры клеточных
стенок, чтобы антибиотик не мог проникнуть
внутрь, переход в состояние споры, при
котором бактерии становятся устойчивыми к
многим антибиотикам.

5.

Сбор биологического материала
Места сбора образцов почв определены по степени
антропогенного воздействия с применением антибиотиков.
Реадовский парк.
Контрольная группа
Берег р. Ясенной

6.

Сбор биологического материала
Cмоленская областная клиническая больница
д. Сметанино

7.

Сбор биологического материала
Районы сбора проб почвы
(https://yandex.ru/map-constructor/)

8.

Методика микробиологического анализа
образцов почв
1. Подготовка образцов.
2. 1г почвы поместили в 5 мл
стерильного физраствора,
встряхнули.
Провели разведение до 10-5.
Пробы почв
3. Посев на питательную среду
методом истощающего штриха
до отдельных колоний.
Пробирки с разведенной
физрастворе почвой
в
Посев проб методом
истощающего штриха

9.

Методика микробиологического анализа
образцов почв
Для посева образцов почв с разведением до 100 и 10-1 использовали две питательных
среды: MacConkey agar и Mueller-Hinton agar, с целью выделения максимально
разнообразных колоний бактерий.
MacConkey agar предназначена для селективного выделения и идентификации
энтеробактерий.
Mueller-Hinton agar предназначен для
определения чувствительности микроорганизмов
к антибактериальным препаратам дискодиффузионным методом, но в данном случае
этот агар служил средой для выявления
микроорганизмов.
Чашки Петри с посеянными образцами

10.

Методика микробиологического анализа
образцов почв
4. 1г почвы поместили в 5 мл
бульона Mueller-Hinton, встряхнули
(оставили для культивирования
микроорганизмов).
Пробирки с почвой, разведенной
в бульоне Mueller-Hinton
5. Поместили в термостат
на 24 часа при температуре +35о.
6. Определение видового
разнообразия выросших колоний
микроорганизмов проводили
с помощью масс-спектрометра.
Термостат
MALDI Масс-спектрометр
(Bruker Daltonics)

11.

Результат микробиологического анализа
образцов почв
Колонии бактерий на среде MacConkey agar (справа)
и Mueller-Hinton agar (слева). Парк Реадовка.
(Разведение 0)
Колонии бактерий на среде MacConkey agar (справа)
и Mueller-Hinton agar (слева). Парк Реадовка
(Разведение 10-1 )

12.

Результаты микробиологического анализа образцов почв
Видовое разнообразие микрофлоры исследуемых образцов почв
Место сбора почв
д. Сметанино
(Smet)
Видовой состав
Acinetobacter soli, Acinetobacter johnsonii, Bacillus sp., Acinetobacter kookii,
Acinetobacter oleivorans, Chryseobacterium gleum, Acinetobacter lwoffii,
Bacillus cereus (1 образец не определен)
Итого определенных видов в образце: 8
Смоленская
Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter kookii, Acinetobacter lwoffii,
Областная
Exiguobacterium acetylicum, Acinetobacter johnsonii, Exiguobacterium sap
Клиническа больница
Итого определенных видов в образце: 6
(SOKB)
Парк Реадовка (Read) Bacillus weihenstephanensis, Kluyvera intermedia, Buttiauxella izardii,
Acinetobacter bereziniae, Serratia liquefaciens, Escherichia coli (2 образца не
определено).
Итого определенных видов в образце: 6
р. Ясенная,
Klebsiella oxytoca, Acinetobacter tandoii, Exiguobacterium sp., Acinetobacter
ул. М. Соколовского lwoffii, Acinetobacter johnsonii, Leclercia adecarboxylata, Acinetobacter kookii
(YASEN)
Итого определенных видов в образце: 7
Вывод: наибольшее видовое разнообразие микроорганизмов в исследуемых образцах почв
определено в образце в д. Сметанино, локация птицефабрики.

13.

Видовое исследование микроорганизмов в образцах почвы
с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции)
1. В работе использована коммерческая система ДНК-сорб-АМ
«Интерлабсервис» для выделения суммарной ДНК из почвы.
Набор реактивов
(https://www.interlabservice.ru/catalog/reagenty/ptsr-diagnostika/vydelenie-iochistka-nukleinovykh-kislot-i-belkov/dnk-sorb-am-forma-5-s-kontrolyami.html)
2. Для анализа 100 мкл почвенной суспензии с разведением 100 в
физиологическом растворе готовится образец выделенной ДНК.
3. Образец анализируется двумя мультиплексными ПЦР-смесями
параллельно, позволяющими определить видовой состав микроорганизмов
в образце:
смесь FL IMP-1 (4 канала детекции),
смесь FL IMP-2 (3 канала детекции).
Амплификатор
детектирующий Дтпрайм
(https://dna-technology.ru/dnaproducts/equipments/rtamplificators/dt_prime)

14.

Результаты системы IMP-1
Канал FAM - ДНК
Escherichia coli
Канал HEХ - ДНК
Klebsiella pneumoniae
Канал ROX - контроль

15.

Результаты системы IMP-2
Канал FAM - ДНК
Enterobacterales
Канал HEХ - ДНК
Enterococcus spp.
Канал ROX - контроль
Вывод: во всех образцах обнаружены бактерии рода Enterobacterales, в образцах из СОКБ и парка Реадовка
выявлена Klebsiella pneumoniae, а в пробах из д. Сметанино и парка Реадовка – Enterococcus spp.

16.

ПЦР-тест для выявления маркеров
антибиотикорезистентности (БакРезиста)
Для посева образцов почв с разведением 100 использовали бульон Mueller-Hinton, с целью
увеличения концентрации микроорганизмов потенциально несущих маркеры резистентности.
Бульон Mueller-Hinton — это жидкая питательная среда, которая используется в
микробиологических лабораториях для наращивания микроорганизмов.
Бульон Mueller-Hinton богат питательными
веществами и имеет низкий уровень ингибиторов.
Это обеспечивает рост любых аэробных
микроорганизмов.
Пробирки с почвой в бульоне Mueller-Hinton.
24 часа инкубирования

17.

ПЦР-тест для выявления маркеров
антибиотикорезистентности (БакРезиста)
1. Используется суммарная ДНК, выделенная из бульонных культур (почвенной суспензии).
2. Осуществляется подготовка ПЦР-смеси набора «БакРезиста GLA».
3. Стрипы помещаются в детектирующий ПЦР-амплификатор.
Стрипы для определения
антибиотикорезистентности
Коммерческая тест-система
БакРезиста GLA (ДНК-Технологи)

18.

Результат определения маркеров
антибиотикорезистентности
Канал СY5
Канал FAM
Канал HEХ - контроль
Вывод: в образце почвы берега р. Ясенной обнаружены ОХА-23-like (канал-FAM) и
NDM (канал СY5).

19.

Результат
определения
Результаты
системымаркеров
IMP-2
антибиотикорезистентности
Канал СY5
Канал FAM
Канал FAM - ДНК
Enterobacterales
Канал HEХ - контроль
Канал HEХ - ДНК
Enterococcus spp.
Канал ROX - контроль
Вывод:
в образце почвы д. Сметанино обнаружены CTX-M-1 (канал FAM) и mec A
Вывод: во всех образцах обнаружены бактерии рода Enterobacterales, в образцах из СОКБ и парка Реадовка
(канал
CY5).
выявлена
Klebsiella pneumoniae, а в пробах из д. Сметанино и парка Реадовка – Enterococcus spp.

20.

Выводы
1. В исследуемых образцах обнаружено наибольшее количество микроорганизмов рода
Acinetobacter spp. – грамотрицательных бактерий из семейства Moraxellaceae, которые
характерны для почвенного биома, но некоторые виды являются условно-патогенными
для человека.
2. У бактерии рода Acinetobacter обнаружен механизм резистентности ОХА-23 в образцах
почв берега р. Ясенной (ул. М. Соколовского), который обуславливает
антибиотикорезистентность к карбапенемам.
3. В образцах почв берега р. Ясенной обнаружен NDM-фермент, который обуславливает
антибиотикорезистентность к карбапенемам.
4. В образце почвы с берега р. Ясенная обнаружены ферменты, которые обеспечивают
устойчивость к антибиотикам, что свидетельствует о наличии канализационных стоков, а
так как водоем является открытым и расположен возле жилых домов, следовательно, это
создает потенциальный риск для здоровья людей.

21.

Выводы
5. Наличие CTX-M-1 в образце почвы д. Сметанино является показателем
высокого уровня антропогенного воздействия (птицеводство), это указывает
на присутствие бактерий, продуцирующих бета-лактамазы расширенного
спектра (БЛРС), которые устойчивы к пенициллинам, цефалоспоринам и
азтреонаму
6. В образцe почвы д. Сметанино обнаружен ген mec A - это основной
генетический маркер метициллин-резистентности у стафилококков,
обеспечивающий устойчивость ко всем бета-лактамным антибиотикам
(пенициллины, цефалоспорины)
7. Во всех образцах почв обнаружены Enterobacterales, что доказывает
фекальные загрязнения. Особенно это актуально для парка Реадовка,
который является рекреационной зоной для жителей города Смоленска.

22.

Рекомендации
1. Канализационные стоки не должны попадать в открытый водоем
(р. Ясенная, которая впадает в р. Днепр), что может вызвать распространение
антибиотикорезистентных организмов в окружающей среде.
2. Река Ясенная требует внимания со стороны администрации г. Смоленска,
так как является местом несанкционированной свалки бытового мусора.
3. Необходимо проведение разъяснительных мероприятий для владельцев
собак о правилах соблюдения выгула собак в общественных местах, которые
предусматривают уборку экскрементов за своим питомцем.
4. В целях профилактики потенциальных рисков не рекомендуется выращивать
сельскохозяйственную продукцию на территориях вблизи объектов, где
применяются антибиотики.

23.

Спасибо за внимание!