Развитие представлений о структуре мембран и модели мембран

1. РАЗВИТИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О СТРУКТУРЕ МЕМБРАН МОДЕЛИ МЕМБРАН

2.

1851 Гуго МОЛЬ (1805—1872) ОПИСАЛ
ПЛАЗМОЛИЗ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК,
ПРЕДПОЛОЖИЛ, ЧТО КЛЕТКИ ОКРУЖЕНЫ
МЕМБРАНОЙ.

3.

1855 К. НАГЕЛИ: КЛЕТОЧНАЯ
ПОВЕРХНОСТЬ – БАРЬЕР ДЛЯ
ПРОНИКНОВЕНИЯ КРАСИТЕЛЯ В КЛЕТКУ

4.

вода
В. Пфеффер
(1845-1920)
раствор
В 1877 г..
опубликовал свой
труд “Исследования
осмоса”, где
постулировал
существование
клеточных мембран,
основываясь на
сходстве между
клетками и
осмометрами,
имеющими
искусственные
полупроницаемые
мембраны, которые
были приготовлены
незадолго до этого
М. Траубе.

5.

Х. де Фриз
(1848-1935)
Автор классических
трудов о
плазмолизе
растительных
клеток и связанных
с этим
исследований
осмотического
давления.
Эти исследования
послужили
фундаментом при
создании физикохимической теории
осмотического
давления и
электролитической
диссоциации.

6.

В 1890 году немецкий физико-химик
и философ В. Оствальд
обратил
внимание
на
возможную
роль
мембран
в
биоэлектрических
процессах.
В. Оствальд
(1853-1932)
В 1902 году Ю.
Бернштейн
(1839-1917)
привлек
для
объяснения
электрических
свойств живых
клеток
мембранную
гипотезу.

7. ЭКСПЕРИМЕНТЫ ОВЕРТОНА

Э. Овертон
(1865–1933)
Э.Овертон (1895) обратил внимание на
корреляцию между скоростью, с которой
небольшие молекулы
проникают в растительные клетки, и их
коэффициентом распределения между маслом и
водой; это привело его к мысли о липидной
природе мембран.

8. ЭКСПЕРИМЕНТ Э.ГОРТЕРА И Ф.ГРЕНДЕЛА

Э.ГОРТЕР И
Ф.ГРЕНДЕЛ
ЭКСТРАГИРОВАЛ
И ЛИПИДЫ ИЗ
МЕМБРАН ТЕНЕЙ
ЭРИТРОЦИТОВ И
НАНОСИЛИ НА
ПОВЕРХНОСТЬ
ВОДЫ

9. БИСЛОЙ ГОРТЕРА - ГРЕНДЕЛА

Предположение Гортера и Грендела
подтвердили
исследования электрических параметров биологических
мембран (Коул и Кёртис, 1935 год): высокое электрическое
сопротивление,
порядка
107 Ом/м2
и
большая
электроемкость 0,51 Ф/м2.

10.

В 1931 году Р. Руденберг получил патент на
просвечивающий электронный микроскоп,
а в 1932 году М. Кнолль и
Э.Руска построили первый прототип
современного прибора.
Эта работа Э. Руски в 1986 году была
отмечена Нобелевской премией по
физике, которую присудили ему и
изобретателям сканирующего зондового
микроскопа Г.Биннигу и Г.Рореру.
Использование просвечивающего
электронного микроскопа для научных
исследований было начато в конце 1930-х
годов.
Электронный микроскоп.
Модель 1960-х годов

11. ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП

ЭЛЕКТРОНЫ
УСКОРЯЮТСЯ
ЭЛЕКТРИЧЕСКИМ
ПОЛЕМ НАПРЯЖЕНИЕМ
105 В, ИХ СКОРОСТЬ
106 М/С,
ДЛИНА ВОЛНЫ 0,1 НМ

12.

Модель Даниелли — Даусона (1935)
Мысль о том, что с мембранами
связаны белки, высказал впервые
Дж. Даниелли в 1935 г. в связи с
необходимостью объяснить явное
расхождение между
поверхностным натяжением на
границе раздела масло — вода и
мембрана — вода.

13. ТРЕХСЛОЙНОЕ ИЗОБРАЖЕНИЕ БИОМЕМБРАНЫ НА ЭЛЕКТРОНОГРАММАХ

Микрофотография
ВНЕКЛЕТОЧНОЕ ПРОСТРАНСТВО
мембраны
эритроцита,
полученная методом
ультратонких срезов
ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ
ПРОСТРАНСТВО
МЕЖДУ ПАРОЙ ТЕМНЫХ ПОЛОС – СВЕТЛОЕ ПРОСТРАНСТВО

14.

Унитарная модель мембраны Робертсона
(1959 г.)
Джеймс Дэвид Робертсон
( 1923 - 1995)

15.

Факты, противоречившие «бутербродной
модели»
1. Четкую трехслойную структуру при электронно-микроскопическом
исследовании обнаруживают далеко не все мембраны.
2. Анализ проблемы трансмембранного транспорта показал, что
мембрана, по-видимому, гораздо лабильнее и динамичнее, чем
это следует из «бутербродной» модели.
3. Изучение белков, входящих в состав мембран, выявило, что
значительная часть мембранных белков имеет глобулярную
структуру.
4. Неустойчивость трехслойной мембраны. Ведь гидрофильные
компоненты липидного слоя оказываются изолированными от
водной фазы сплошным слоем гидрофильных белковых молекул.
Такая система требует для поддержания своей структуры
значительных затрат энергии.

16.

АСИММЕТРИЯ МЕМБРАН:
данные дифракции рентгеновских лучей,
свидетельствовавшие о неодинаковом характере
распределения электронной плотности на противолежащих
сторонах мембраны.

17.

Дальнейшее
развитие
техники
электронной
микроскопии,
сопровождавшееся улучшением разрешения, и в частности
применение
нового
метода,
основанного
на
негативном
контрастировании мембранных препаратов, позволило выявить
морфологически
более
сложную
картину
структурной
организации биологических мембран.
Оказалось, что во многих случаях, и особенно на микрофотографиях
внутриклеточных органелл, мембрана выглядит не как сплошная
трехслойная линия, а как гранулярная структура, имеющая разрывы
(или поры) и состоящая из отдельных глобулярных частиц.

18.

Модель Шёстранда (1963 г.)
Глобулярные частицы в
мембране представляют собой
липиды в форме мицелл.
Полярные головки липидных
молекул находятся на
поверхности мицелл, покрытых
слоем белка.
Модель Люси (1964)
Мицеллярная форма
приписывалась не только
липидам, но и белкам, а вся
мембрана рассматривалась как
структура, построенная из
чередующихся липидных
мицелл и белковых глобул.

19.

Модель «ковра»
Модель
А.А.Бенсона
(1966)
Мембрана рассматривается как ассоциат
липопротеиновых комплексов своеобразной структуры, в
которых углеводородные цепи липидов тесно переплетены
с белковой полипептидной цепью и удерживаются ею за
счет гидрофобных взаимодействий;
при этом отрицательно заряженные головки
фосфолипидов находятся на поверхности липопротеиновых
комплексов.

20.

МЕТОД ЗАМОРАЖИВАНИЯ - СКАЛЫВАНИЯ
Благодаря К. Мюлеталеру (1963) и впоследствии Д. Брэнтону (1966)
был разработан новый вариант электронной микроскопии, не
требующий предварительной фиксации и окрашивания мембранного
препарата и потому устраняющий возможность появления связанных с
данными операциями артефактов.
Метод: «замораживание — скалывание», и его модификация,
известная как «замораживание — травление»

21.

Косвенные данные говорили о том, что
внутримембранные частицы имеют белковую природу.

22. ЭЛЕКТРОНОГРАММА ПОВЕРХНОСТЕЙ СКОЛА БИОМЕМБРАНЫ (МЕТОД ЗАМОРАЖИВАНИЯ - СКАЛЫВАНИЯ)

ЭЛЕКТРОНОГРАММА ПОВЕРХНОСТЕЙ СКОЛА
БИОМЕМБРАНЫ (МЕТОД ЗАМОРАЖИВАНИЯ СКАЛЫВАНИЯ)
ВЫСТУПАМ (15) НА ЛЕВОЙ
ПОВЕРХНОСТИ
СООТВЕТСТВУЮ
Т ВМЯТИНЫ (1*
- 5*)

23.

РАЗВИТИЕ БИОХИМИИ БЕЛКОВ
Данные спектральных исследований:
для
мембранных
белков
характерно
высокое
содержание α-спиралей, они, вероятно, образуют
глобулы, а не распределены в виде монослоя на
поверхности липидного бислоя.

24.

Данные электрофореза в полиакриламидном
геле в присутствии анионного детергента —
додецилсульфата натрия:
Большинство мембран содержат
весьма богатый набор белков,
причем точное определение их
числа
в
каждой
мембране
ограничивается главным образом
разрешающей
способностью
методов,
используемых
для
анализа.
Эти работы положили начало
широкому
использованию
различных
детергентов
для
выделения, очистки и анализа
индивидуальных
мембранных
белков.

25.

Открытие В. Луццати в 1968 г. фазового
полиморфизма водно-липидных систем, а
также установление того факта, что во
многих природных мембранах липиды
при физиологических температурах
находятся в жидкокристаллическом
состоянии.
Д. Чепмен (1966): концепция
текучести липидного бислоя.
Мембраны - подвижная,
динамичная система,
обладающая свойствами
двумерной жидкости.
Измерения скорости
латеральной диффузии
липидов как в биологических,
так и в модельных мембранах
(Л. Д. Фрай и М. Эдидин, 1970 г.
и Г. М. Мак-Коннел, 1971 г.)

26.

С.Сингер и Г.Николсон свели воедино все эти идеи, создав
жидкостно-мозаичную модель мембраны.
Г. Николсон и С. Сингер
СХЕМА ЖИДКОСТНО-МОЗАИЧНОЙ МОДЕЛИ
МЕМБРАНЫ С.СИНГЕРА И Г.НИКОЛСОНА (1972 г.)

27. МОДЕЛЬ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТА

28. ЭТАПЫ ИЗУЧЕНИЯ МЕМБРАН

29.

30. ФУНКЦИИ МЕМБРАН

31.

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И
ИССЛЕДОВАНИЯ
БИОМЕМБРАН

32.

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ МЕМБРАН
НЕДЕСТРУКТИВНЫЕ
ПОЛУЧЕНИЕ МЕМБРАННЫХ
ВЕЗИКУЛ БЕЗ РАЗРУШЕНИЯ
КЛЕТОК
Используемые клетки:
опухолевые
клетки крови (эритроциты, лимфоциты,
тромбоциты)
фибробласты
изолированные гепатоциты и др.
ДЕСТРУКТИВНЫЕ
ОСМОТИЧЕСКИЙ ШОК КЛЕТОК
ГОМОГЕНИЗАЦИЯ ТКАНЕЙ

33.

НЕДЕСТРУКТИВНЫЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ МЕМБРАН
Группа методик, основанная на
получении мембранных
фрагментов, которые
отделяются от поверхности
клеток в виде везикул.
ИНКУБАЦИЯ КЛЕТОК В СРЕДАХ
ОПРЕДЕЛЕННОГО СОСТАВА
ПРИВОДИТ К
СПОНТАННОМУ ОТДЕЛЕНИЮ ОТ ИХ
ПОВЕРХНОСТИ ВЕЗИКУЛ
Пузырьки
(везикулы)
ВЕЗИКУЛЫ ЗАТЕМ ОТДЕЛЯЮТСЯ ОТ
КЛЕТОЧНОЙ СУСПЕНЗИИ ПУТЕМ
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ ПРИ НИЗКИХ
СКОРОСТЯХ (500 g)

34.

ВЕЗИКУЛЫ, ОТДЕЛЯЮЩИЕСЯ ОТ ОПУХОЛЕВОЙ КЛЕТКИ

35.

Иногда мембранные фрагменты
могут отделяться не только от
клеток, но и от целых
организмов.
Например, у шистозом
(кровяные сосальщики) (класс
Трематоды) везикулы
отделяются от поверхности
тегумента.
Электронограмма тегумента
шистозомы

36. ДЕСТРУКТИВНЫЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ МЕМБРАН

1. ГИПООСМОТИЧЕСКИЙ ШОК
ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕНЕЙ ЭРИТРОЦИТОВ
ЭРИТРОЦИТЫ
ТЕНИ ЭРИТРОЦИТОВ
ПРАВИЛЬНОЙ ОРИЕНТАЦИИ
ТЕНИ ЭРИТРОЦИТОВ
ВЫВЕРНУТЫЕ

37.

ЭРИТРОЦИТАРНАЯ МЕМБРАНА - удобная модель для изучения
структурно-функциональных модификаций биомембран,
индуцированных воздействием целого ряда физико-химических
агентов
причины:
однородность мембранного препарата, легкость его получения с
сохранением нативных свойств;
выполнение эритроцитарными мембранами различных функций:
барьерной, транспортной, рецепторной, механической,
метаболической и др.;
наличие в эритроцитарных мембранах и клетках ферментных
систем, регулирующих энергетические, окислительные процессы,
транспорт ионов, пероксидное окисление липидов; генерирующих
и утилизирующих активные формы кислорода.

38.

2. ГОМОГЕНИЗАЦИЯ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
Для измельчения бактериальных
или дрожжевых клеток
используют стеклянный
гомогенизатор, называемый
«бактериальной мельницей»
1 — стеклянный конус, растирающий
бактериальные клетки, поступающие в
виде суспензии через горлышко
воронки; 2 — штекер для соединения с
электромотором, вращающим
стеклянный конус; стрелкой обозначено
место подачи бактериальной
суспензии)

39.

Для приготовления небольших объемов
гомогенатов мягких тканей используют
простой гомогенизатор Поттера—
Эльвейема.
Гомогенизатор Поттера — Эльвейема
(1 — стеклянная толстостенная
пробирка;
2 — пестик, пришлифованный к
нижней части пробирки).

40.

Ручные гомогенизаторы
для разрушения тканей
или клеток различного
происхождения
(клеточные культуры ,
пробы биопсии
селезенки, печени или
мышц).
Ручные гомогенизаторы Даунса

41.

Гомогенизатор для измельчения
относительно больших количеств
тканей:
1 — стакан;
2 — режущие лопасти;
3 — ось электродвигателя;
4 — корпус с электродвигателем.

42.

3. РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОК С ПОМОЩЬЮ КАВИТАЦИИ ГАЗОВ
Р=7 – 65 атм
P уменьшают
до атмосферного
N2
кавитация
Разрушение
клеток
́ ия — физический процесс образования
Кавитац
пузырьков в жидких средах, с последующим их
схлопыванием и высвобождением большого
количества энергии, которое сопровождается
шумом и гидравлическими ударами.

43.

4. РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОК С
ПОМОЩЬЮ УЛЬТРАЗВУКА
Мышечные ткани, ткани печени, тучные клетки,
лимфоциты могут быть разрушены для
дальнейшего анализа, либо использования их
содержимого.

44.

После разрушения клеток высвобождаются многие лизосомальные
ферменты, ранее изолированные в соответствующих компартментах.
ПРОБЛЕМА: ингибирование протеаз

45.

ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ МЕМБРАННЫХ ФРАКЦИЙ ИСПОЛЬЗУЮТ
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Частицы в растворе
осаждаются (седиментация), когда их плотность выше плотности
раствора.
всплывают (флотация), когда их плотность ниже плотности раствора.
Когда плотности частиц и раствора одинаковые (изопикнические
условия), частицы остаются неподвижными.
При малой разнице в плотности частицы можно разделить только
в центрифуге, которая создаёт центробежную силу, во много раз
превышающую силу земного притяжения.
Угловой ротор

46.

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ (при постоянном
центробежном ускорении)
ХАРАКТЕРИСТИКИ ВЕЩЕСТВА, ИСПОЛЬЗУЕМОГО ДЛЯ
ПРИГОТОВЛЕНИЯ ГРАДИЕНТА:
Хорошо растворяется в воде
Получаемый раствор обладает низкой вязкостью
Раствор прозрачен для видимого света и УФ
Создает низкое осмотическое давление
ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ВЕЩЕСТВА ДЛЯ СОЗДАНИЯ ГРАДИЕНТА
ПЛОТНОСТИ:
CsCl
Сахароза

47.

48.

МЕТОД ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ (при различном центробежном
ускорении )
Центробежное
ускорение
выражают
величиной,
которая кратна
ускорению
свободного
падения g=9,81
м/с2

49.

После выделения субклеточных фракций необходимо их
идентифицировать и проверить степень загрязненности
другими органеллами.
ОЦЕНКА ЧИСТОТЫ МЕМБРАННЫХ ФРАКЦИЙ
Наиболее часто для оценки чистоты выделенных мембранных
фракций используют методы исследования удельной активности
ферментов, называемых маркерами.
Маркерные ферменты должны быть локализованы в определенном
типе мембранных структур и катализировать реакции,
соответствующие специфическим функциям этих мембран.
Кроме того, фермент можно использовать как маркер, если он
прочно связан с мембраной и не подвергается активации или
ингибированию при разделении мембранных фракций .

50. КРАТКИЙ ОБЗОР ГРУПП МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОМЕМБРАН (для самостоятельного ознакомления)

БИОХИМИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ
позволяют разделять, выделять и
анализировать в чистом виде
липидные и белковые компоненты,
изучать их физико-химические
свойства в свободном состоянии и в
составе надмолекулярных
комплексов
используют для изучения
функционирования естественных и
искусственных мембран.
Исследование проницаемости
мембран, процессы возбуждения,
торможения, проведения нервного
импульса, распределения и
выведения ионов и молекул из клеток
и тканей, изменения
физиологических функций клеток

51.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ
используются для идентификации
мембранных компонентов, их
локализации, оценки количества
выделения.
основаны на использовании
мутантов, дефектных по синтезу
определенных мембранных белков.
Они позволяют исследовать
функции мембранных белков, их
роль в функционировании мембран,
проблемы самоорганизации
мембран.

52.

БИОФИЗИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ
позволяют изучать
динамическую организацию биомембран,
упаковку и движение липидных молекул в природных и
модельных мембранах, их взаимодействие друг с другом и
молекулами белков,
фазовые переходы и др.
дифракционные методы (рентгеновская дифракция,
дифракция нейтронов),
резонансные методы,
метод электронной микроскопии,
оптические методы (круговой дихроизм, дисперсия оптического
вращения, абсорбционная спектроскопия, люминесценция,
метод флуоресцентных зондов),
метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии,
метод моделирования и получения искусственных мембран и др.